鸭瘟病毒gC基因疫苗在鸭体内分布规律及gC、gE基因缺失株的构建和生物学特性的初步研究

发布时间：2021-03-01 19:50

　　作为疱疹病毒目（Herpesvirales）疱疹病毒科（Herpesvirales）α-疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirinae）马立克病毒属（Mardivirus）的一员,鸭瘟病毒（Duck plague virus, DPV）是一种泛嗜性全身性感染病毒,主要引起鸭、鹅、天鹅等雁形目水禽的急性接触性传染病——鸭瘟。该病以血管损伤、组织出血、消化道黏膜糜烂、淋巴器官出现病变及实质器官的退行性变化为特征,是影响水禽养殖业的重要疫病。目前,主要依靠接种灭活疫苗和鸡胚化弱毒苗来预防鸭瘟的发生。灭活疫苗安全性好,但免疫维持期短、剂量较大、成本较高；鸡胚化弱毒苗虽然免疫效果较好,但是存在毒力返强和隐性带毒等安全隐患,而且现有的诊断方法无法区别自然感染野毒和弱毒疫苗免疫的动物。因此,研制更为安全有效的新型基因工程疫苗具有重要的理论和应用价值。生物信息学分析表明鸭瘟病毒糖蛋白C （glycoprotein C, gC）在不同毒株间高度保守,原核表达结果显示gC具有良好的免疫原性。因此,本研究选择gC基因作为保护性抗原基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）以构建鸭瘟病毒gC基因疫... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：124 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
常用英文缩写词汇
目录
第一部分 引言
    1. 鸭瘟病毒研究概况
        1.1. 鸭瘟病毒发现历史及名称
        1.2. 鸭瘟病毒的分类地位
        1.3. 鸭瘟病毒生物学特性
        1.4. 鸭瘟病毒分子生物学研究现状
        1.5. 鸭瘟病毒gC、gE基因研究现状
    2. 鸭瘟病毒gC基因在基因疫苗研究中的应用
    3. 定量PCR在检测基因疫苗体内分布规律研究中的优越性
    4. gC、gE基因缺失株在鸭瘟病毒研究中的意义
第二部分 实验研究
    1. 实验目的和意义
    2. 实验材料
        2.1. 病毒毒株、细菌菌株
        2.2. 实验动物
        2.3. 质粒和载体
        2.4. 分子生物学试剂和耗材
        2.5. 常用实验试剂及配制
        2.6. 常用实验设备
    3. 实验方法
        3.1. 鸭瘟病毒gC基因真核表达质粒的构建与鉴定
            3.1.1. 鸭瘟病毒gC基因片段的获取
            3.1.2. 真核表达载体pcDNA3.1（+）的线性化
            3.1.3. 感受态细胞的制备
            3.1.4. 线性化pcDNA3.1（+）和DPV gC基因片段的连接
            3.1.5. 重组质粒的转化
            3.1.6. 重组质粒的抽提、酶切鉴定与保存
            3.1.7. 间接免疫荧光法检测pcDNA-DPV-gC在真核细胞中的表达
        3.2. 定量PCR检测鸭瘟病毒gC基因疫苗在鸭体内分布规律
            3.2.1. 真核表达质粒pcDNA-DPV-gC的制备
            3.2.2. 基因枪“子弹”的制备及初步使用
            3.2.3. 壳聚糖/pcDNA-DPV-gC复合物的制备
            3.2.4. 脂质体/pcDNA-DPV-gC复合物制备
            3.2.5. 试验分组与免疫
            3.2.6. 样品采集
            3.2.7. 模板DNA的提取
            3.2.8. 定量PCR检测鸭瘟病毒gC基因疫苗在鸭体内的动态分布规律
        3.3. 鸭瘟病毒gC基因缺失株的构建与鉴定
            3.3.1. 鸭瘟病毒基因组核酸的制备
            3.3.2. 转移载体左右臂的构建和鉴定
            3.3.3. 重组质粒pUC-△gC的构建
            3.3.4. EGFP表达盒的获取
            3.3.5. 含EGFP基因表达盒转移质粒载体的构建
            3.3.6. 重组鸭瘟病毒DPV-△gC-EGFP的构建
            3.3.7. 重组鸭瘟病毒DPV-△gC-EGFP的鉴定
        3.4. 重组鸭瘟病毒DPV-△gC-EGFP的生物学特性研究
            3.4.1. 空斑试验
            3.4.2. 一步生长曲线
            3.4.3. 形态学观察
            3.4.4. 动物实验
        3.5. 鸭瘟病毒gE基因缺失株的构建与鉴定
            3.5.1. 转移载体左右臂的构建和鉴定
            3.5.2. 重组质粒pUC-△gE-EGFP的构建
            3.5.3. 重组鸭瘟病毒DPV-△gE-EGFP的构建与鉴定
        3.6. 重组鸭瘟病毒DPV-△gE-EGFP的生物学特性研究
            3.6.1. 空斑试验
            3.6.2. 一步生长曲线
            3.6.3. 形态学观察
            3.6.4. 动物实验
    4. 实验结果
        4.1. 真核表达质粒pcDNA-DPV-gC的构建与鉴定
            4.1.1. 真核表达质粒pcDNA-DPV-gC的构建结果
            4.1.2. 间接免疫荧光鉴定pcDNA-DPV-gC在COS-7细胞中的表达
        4.2. 鸭瘟病毒gC基因疫苗在鸭体内分布规律
            4.2.1. 高密度发酵影响因素
            4.2.2. 鸭瘟病毒gC基因疫苗的鉴定
            4.2.3. 免疫接种鸭临床表现及组织DNA抽提情况
            4.2.4. 定量PCR检测鸭瘟病毒gC基因疫苗在接种鸭体内分布情况
        4.3. 鸭瘟重组病毒DPV-△gC-EGFP的构建与鉴定
            4.3.1. 转移载体pUC-△gC-EGFP的构建
            4.3.2. 鸭瘟重组病毒DPV-△gC-EGFP的构建与生长特性初步观察
            4.3.3. 鸭瘟重组病毒DPV-△gC-EGFP的鉴定
        4.4. 鸭瘟重组病毒DPV-△gC-EGFP的生物学特性初步观察
            4.4.1. 鸭瘟重组病毒DPV-△gC-EGFP的空斑试验结果
            4.4.2. 鸭瘟重组病毒DPV-△gC-EGFP的一步生长曲线
            4.4.3. 鸭瘟重组病毒DPV-△gC-EGFP的形态观察
            4.4.4. 鸭瘟重组病毒DPV-△gC-EGFP对鸭的致病性
            4.4.5. 鸭瘟重组病毒DPV-△gC-EGFP引起鸭中和抗体的变化
            4.4.6. 鸭瘟重组病毒DPV-△gC-EGFP对鸭的保护作用
        4.5. 重组鸭瘟病毒DPV-△gE-EGFP的构建与鉴定
            4.5.1. 转移载体pUC-△gE-EGFP的构建
            4.5.2. 重组鸭瘟病毒DPV-△gE-EGFP的构建与生长特性初步观察
            4.5.3. 重组鸭瘟病毒DPV-△gE-EGFP的鉴定结果
        4.6. 重组鸭瘟病毒DPV-△gE-EGFP的生物学特性初步观察
            4.6.1. 重组鸭瘟病毒DPV-△gE-EGFP的空斑试验结果
            4.6.2. 重组鸭瘟病毒DPV-△gE-EGFP的一步生长曲线
            4.6.3. 重组鸭瘟病毒DPV-△gE-EGFP的形态观察
            4.6.4. 重组鸭瘟病毒DPV-△gE-EGFP对鸭的致病性
            4.6.5. 重组鸭瘟病毒DPV-△gE-EGFP引起鸭的中和抗体变化
            4.6.6. 重组鸭瘟病毒DPV-△gE-EGFP对鸭的保护作用
    5. 讨论
        5.1. 真核表达质粒pcDNA-DPV-gC的构建与鉴定
            5.1.1. 真核表达质粒pcDNA-DPV-gC的构建
            5.1.2. 真核表达质粒的鉴定
        5.2. 鸭瘟病毒gC基因疫苗在雏鸭体内分布规律
            5.2.1. 基因组核酸样品中影响定量PCR反应的因素
            5.2.2 .免疫佐剂对鸭瘟病毒gC基因疫苗在雏鸭体内分布的影响
            5.2.3. 免疫途径对鸭瘟病毒gC基因疫苗在雏鸭体内分布的影响
            5.2.4. 免疫剂量对鸭瘟病毒gC基因疫苗在雏鸭体内分布的影响
        5.3. 鸭瘟病毒基因缺失株构建方法的选择
        5.4. 不同空斑检测方法在鸭瘟病毒研究方面的应用
        5.5. 鸭瘟病毒gC缺失重组株生物学特性初步研究结果
        5.6. 鸭瘟病毒gE缺失重组株生物学特性初步研究结果
第三部分 总结
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表学术论文情况


【参考文献】：
期刊论文
[1]鸭瘟病毒gD基因胞外区的原核表达及ELISA检测方法的建立与应用[J]. 范薇,程安春,汪铭书,隋丽华,孙岩松.  中国兽医科学. 2012(05)
[2]鸭肠炎病毒核衣壳蛋白受体的筛选与鉴定[J]. 张荷,毛君婷,杨颖,王开功,周碧君,文明.  病毒学报. 2012(01)
[3]鸭肠炎病毒gC糖蛋白胞外区优势抗原表位的筛选与鉴定[J]. 崔立虹,宋鸽,王晓东,刘晓玫,高明春,张文龙,马波,王君伟.  畜牧兽医学报. 2011(08)
[4]鸭瘟病毒UL47基因克隆及其分子特性分析[J]. 罗丹丹,程安春,汪铭书,沈爱梅,朱德康,贾仁勇,罗启慧,崔恒敏,王印,徐志文.  中国兽医学报. 2011(01)
[5]鸭瘟病毒UL35基因克隆、原核表达及在病毒感染宿主中的亚细胞定位[J]. 蔡铭升,程安春,汪铭书,朱德康,罗启慧,招丽婵,贾仁勇,刘菲,陈孝跃.  病毒学报. 2010(02)
[6]鸭肠炎病毒UL41、UL42基因的克隆与分析[J]. 陈普成,柳金雄,曾青华,姜永萍,田国彬,陈化兰.  中国预防兽医学报. 2009(12)
[7]鸭瘟病毒UL26.5基因的克隆和编码蛋白的亚细胞定位[J]. 张瑶,程安春,汪铭书,贾仁勇,朱德康,刘菲,罗启慧,陈孝跃.  中国兽医科学. 2009(11)
[8]鸭瘟病毒UL51基因在COS-7细胞中的瞬时表达[J]. 沈婵娟,程安春,汪铭书,郭宇飞,信洪一,徐超,贾仁勇,韩新峰.  中国兽医科学. 2009(10)
[9]鸭肠炎病毒VP22蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 王克雄,李慧昕,李阳,邵昱昊,韩宗玺,马小军,刘胜旺,孔宪刚.  中国预防兽医学报. 2009(09)
[10]SARS-CoV细胞空斑试验[J]. 蒋虹,乔红伟,丛喆,佟巍,魏强.  中国比较医学杂志. 2009(08)

博士论文
[1]鸭瘟病毒gC基因的发现、原核表达和应用研究[D]. 徐超.四川农业大学 2008

硕士论文
[1]鸭瘟病毒gC基因部分特征分析及gC基因疫苗诱导鸭免疫发生的研究[D]. 练蓓.四川农业大学 2011
[2]鸭肠炎病毒gC基因疫苗诱导BALB/c小鼠免疫发生的研究[D]. 蒋金凤.四川农业大学 2010
[3]鸭瘟病毒gC基因疫苗在雏鸭体内的抗原表达时相和分布规律[D]. 沈福晓.四川农业大学 2010
[4]基于DEV gC基因FQ-PCR方法建立及gC基因疫苗在免疫小鼠体内分布规律的研究[D]. 邹庆.四川农业大学 2010
[5]鸭α-干扰素基因疫苗高密度发酵及免疫鸭抗鸭瘟强毒人工感染的研究[D]. 周雪.四川农业大学 2007
[6]小鹅瘟病毒VP3基因疫苗在免疫雏鹅体内动态分布及表达规律的研究[D]. 黎敏.四川农业大学 2007
[7]鸭α-干扰素核酸疫苗在鸭体内的动态分布及表达产物抗鸭瘟强毒效果初探[D]. 段坤.四川农业大学 2007



本文编号：3057947