真菌毒素玉米赤霉烯酮降解酶基因资源挖掘及其催化效率分子改良研究
发布时间：2021-03-01 18:11
玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）是镰刀菌产生的类雌激素样真菌毒素,不仅损伤动物的肝肾,降低免疫机能,而且影响动物的生殖性能,给牲畜养殖业及食品安全带来了严重的危害。内酯水解酶可以高效、环保的方式去除饲料中的霉菌毒素ZEN,有效助力畜牧行业绿色健康养殖。本研究旨在获得可高效水解ZEN的酶,研究其生化特性以及催化机理,探索高效表达方案,推进其在畜牧养殖业的应用。为了进一步挖掘可高效水解ZEN的酶基因资源,以具有ZEN水解活性的内酯水解酶ZHD101的氨基酸序列出发,在NCBI数据库进行检索分析,获得了18个一致性较低的潜在ZEN水解酶基因序列,并通过在毕赤酵母中异源表达进行活性筛选。结果表明:所有基因均实现了异源表达,5个检测到明显活性。其中,来源于Phialophora americana的假想蛋白ZHD607对ZEN的降解效率高达100%,比活达到4940 U/mg。为了进一步研究其催化机理,本研究选取了与ZHD607一致性较高（74%）的内酯水解酶RmZHD为对比材料。RmZHD具有更高的比活性（12,288 U/mg）,是ZHD607的2.5倍。通过对ZHD607进行...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
玉米赤霉烯酮及雌激素的化学结构式Fig.1-1Chemicalstructuralformulaofzearalenoneandestrogen
中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论6图1-2ZEN的水解过程Fig.1-2HydrolysisofZEN1.3.2ZEN降解酶研究进展目前为止，已被成功分离并进行异源表达的ZEN降解酶基因不多，其中zhd101是被研究最多的一个降解酶基因，已成功在大肠杆菌（Escherichiacoli），毕赤酵母（PichiaPastoris），乳杆菌（Lactobacillusreuteri），水稻（Rice）等宿主中表达（WANGetal.,2018;YANGetal.,2017;HIGA-NISHIYAMAetal.,2005）6。ZHD101为内酯水解酶，内酯酶因为会干扰群体感应系统，调节微生物生长和发病机制而受到广泛关注。“猝灭”群体信号的一个主要机制是通过内酯酶和酰基水解酶裂解和灭活细菌N-酰基高丝氨酸内酯（AHL）。ZEN和AHL的化学结构非常不同，相应的开环反应和催化酶也是如此。AHL内酯酶包括metallo-β-内酰胺酶折叠酶、(β/α)8-氨基水解酶折叠酶和α/β-水解酶折叠酶。ZHD101属于后者（PENGetal.,2014）6。与其他一些AHL内酯酶（如AiiA）不同，ZHD101不需要金属离子辅助发挥活性。除了具有包含Ser/Cys-His-Asp/Glu催化三联体的催化核心结构域外，α/β-水解折叠内酯酶（如烯醇内酯水解酶PcaD）还包含α-螺旋帽子结构域，覆盖活性部位并确定底物特异性。在核心结构域和帽子结构域之间有一个深的隧道状空腔来容纳底物。ZHD101被发现后，其他酶也相继被发现具有明显的ZEN降解效果。例如，从Rhinocladiellamackenziei分离得到的ZHD518对ZEN、α-zearalenol、β-zearalenol、α-zearalanol和β-zearalanol具有显著的内酯水解酶活性，其活性分别为12,420、1,380、3,882、7,188和3,990U/mg（WANGetal.,2018）6。CbZHD来源于Cladophialophorabantiana，对ZEN和α-zearalenol具有内酯水解酶活性（分别为12,301和2,163U/mg），但这些内酯水解酶的水解效率较?
中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论7Ser102-His242-Glu126，进一步确认了催化三联体的酸性残基是Glu126，而不是先前提出的Asp223。在催化三联体的作用下，ZEN的内酯环可被裂解并伴随着二氧化碳释放，生成二羟基苯甲基衍生物，然后从活性部位移出。Glu126位于β6折叠片的C末端，距离与位于β5的Ser102很近。His242位于靠近β8-β11的loop上，在S102A/ZEN复合物中，His242的NE2原子与ZEN的酯氧（O10’）的距离为3.4，为质子转移到底物提供了便利。当突变体与野生型结构叠加时发现，Ser102的OG原子与ZEN的羰基碳（C12）相距2.2，具有很高的亲核攻击潜力。羰基氧（O12）与Gly32的NH形成氢键，可能对稳定过渡态中的负电荷有积极作用。图1-3ZHD101单体结构（PDBID:3WZM）Fig.1-3StructureofZHD101monomer（PDBID:3WZM）在催化口袋的另一侧，Trp183垂直于ZEN的二羟基苯甲酸环，在两个芳香族基团之间形成T-堆叠相互作用，并且Trp183的NE1与底物的O2形成氢键，与Ser103的侧链（OG）也形成氢键。郭瑞庭等人研究发现突变体W183F、W183H和W183A均为ZEN降解活性，表明了Trp183对于催化活性的重要作用。除Trp183的吲哚基外，Leu33、Val153、Met154、Val158、Leu135、Phe221、Pro128、Ile191和Pro192的脂肪族侧链与底物直接接触。对于Trp183，QI等（2017）人还发现对于ZHD-ZEN和ZHD-ZGR（产物）复合物结构的比较表明，亲水性相互作用发生了变化，特别是Trp183N1从与O2相互作用转变为与O12’相互作用，表明Trp183是催化过程中ZEN苯酚环单向平移运动的原因。这种结构提供了玉米赤霉烯酮内酯水解酶催化机理的最后阶段的构象变化信息（图1-4）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]生长抑素和耐热木聚糖酶的融合表达及性质研究[J]. 黄坤龙,苏小运,姚斌. 生物技术通报. 2020(09)
[2]饲料中玉米赤霉烯酮的危害和脱毒方法研究进展[J]. 吴先斌. 福建畜牧兽医. 2016(06)
[3]国内外真菌毒素检测方法研究现状及进展[J]. 张思思,陆继伟,王少敏,毛丹,苗水,季申. 食品安全质量检测学报. 2016(07)
[4]饲料中霉菌毒素的检测方法研究[J]. 范伟杰. 饲料工业. 2016(11)
[5]粮食中真菌毒素检测技术研究进展[J]. 陈云良. 食品安全导刊. 2016(12)
[6]低剂量玉米赤霉烯酮和吸附剂对育成期蛋鸡生长性能、血清生化指标和抗氧化指标的影响[J]. 伍宇超,杨维仁,杨在宾,姜淑贞,张桂国,姜新超. 动物营养学报. 2016(04)
[7]饲料中玉米赤霉烯酮检测及脱毒技术的研究进展[J]. 葛文霞,柳旭伟,张文举,刘晓娜. 安徽农业科学. 2016(01)
[8]玉米赤霉烯酮对猪生产的影响及其毒性吸附研究[J]. 陈继发,曲湘勇,彭灿阳,彭豫东. 动物营养学报. 2016(03)
[9]饲料及食品中玉米赤霉烯酮检测方法研究进展[J]. 任丹丹,谢云峰,李少晖,杨永坛. 分析测试技术与仪器. 2015(04)
[10]γ-射线降解玉米粉中玉米赤霉烯酮的效果及降解动力学研究[J]. 赵琳,张瑞英,兰静,金海涛,任红波,孙向东. 食品工业科技. 2016(07)
本文编号：3057838
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
玉米赤霉烯酮及雌激素的化学结构式Fig.1-1Chemicalstructuralformulaofzearalenoneandestrogen
中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论6图1-2ZEN的水解过程Fig.1-2HydrolysisofZEN1.3.2ZEN降解酶研究进展目前为止，已被成功分离并进行异源表达的ZEN降解酶基因不多，其中zhd101是被研究最多的一个降解酶基因，已成功在大肠杆菌（Escherichiacoli），毕赤酵母（PichiaPastoris），乳杆菌（Lactobacillusreuteri），水稻（Rice）等宿主中表达（WANGetal.,2018;YANGetal.,2017;HIGA-NISHIYAMAetal.,2005）6。ZHD101为内酯水解酶，内酯酶因为会干扰群体感应系统，调节微生物生长和发病机制而受到广泛关注。“猝灭”群体信号的一个主要机制是通过内酯酶和酰基水解酶裂解和灭活细菌N-酰基高丝氨酸内酯（AHL）。ZEN和AHL的化学结构非常不同，相应的开环反应和催化酶也是如此。AHL内酯酶包括metallo-β-内酰胺酶折叠酶、(β/α)8-氨基水解酶折叠酶和α/β-水解酶折叠酶。ZHD101属于后者（PENGetal.,2014）6。与其他一些AHL内酯酶（如AiiA）不同，ZHD101不需要金属离子辅助发挥活性。除了具有包含Ser/Cys-His-Asp/Glu催化三联体的催化核心结构域外，α/β-水解折叠内酯酶（如烯醇内酯水解酶PcaD）还包含α-螺旋帽子结构域，覆盖活性部位并确定底物特异性。在核心结构域和帽子结构域之间有一个深的隧道状空腔来容纳底物。ZHD101被发现后，其他酶也相继被发现具有明显的ZEN降解效果。例如，从Rhinocladiellamackenziei分离得到的ZHD518对ZEN、α-zearalenol、β-zearalenol、α-zearalanol和β-zearalanol具有显著的内酯水解酶活性，其活性分别为12,420、1,380、3,882、7,188和3,990U/mg（WANGetal.,2018）6。CbZHD来源于Cladophialophorabantiana，对ZEN和α-zearalenol具有内酯水解酶活性（分别为12,301和2,163U/mg），但这些内酯水解酶的水解效率较?
中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论7Ser102-His242-Glu126，进一步确认了催化三联体的酸性残基是Glu126，而不是先前提出的Asp223。在催化三联体的作用下，ZEN的内酯环可被裂解并伴随着二氧化碳释放，生成二羟基苯甲基衍生物，然后从活性部位移出。Glu126位于β6折叠片的C末端，距离与位于β5的Ser102很近。His242位于靠近β8-β11的loop上，在S102A/ZEN复合物中，His242的NE2原子与ZEN的酯氧（O10’）的距离为3.4，为质子转移到底物提供了便利。当突变体与野生型结构叠加时发现，Ser102的OG原子与ZEN的羰基碳（C12）相距2.2，具有很高的亲核攻击潜力。羰基氧（O12）与Gly32的NH形成氢键，可能对稳定过渡态中的负电荷有积极作用。图1-3ZHD101单体结构（PDBID:3WZM）Fig.1-3StructureofZHD101monomer（PDBID:3WZM）在催化口袋的另一侧，Trp183垂直于ZEN的二羟基苯甲酸环，在两个芳香族基团之间形成T-堆叠相互作用，并且Trp183的NE1与底物的O2形成氢键，与Ser103的侧链（OG）也形成氢键。郭瑞庭等人研究发现突变体W183F、W183H和W183A均为ZEN降解活性，表明了Trp183对于催化活性的重要作用。除Trp183的吲哚基外，Leu33、Val153、Met154、Val158、Leu135、Phe221、Pro128、Ile191和Pro192的脂肪族侧链与底物直接接触。对于Trp183，QI等（2017）人还发现对于ZHD-ZEN和ZHD-ZGR（产物）复合物结构的比较表明，亲水性相互作用发生了变化，特别是Trp183N1从与O2相互作用转变为与O12’相互作用，表明Trp183是催化过程中ZEN苯酚环单向平移运动的原因。这种结构提供了玉米赤霉烯酮内酯水解酶催化机理的最后阶段的构象变化信息（图1-4）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]生长抑素和耐热木聚糖酶的融合表达及性质研究[J]. 黄坤龙,苏小运,姚斌. 生物技术通报. 2020(09)
[2]饲料中玉米赤霉烯酮的危害和脱毒方法研究进展[J]. 吴先斌. 福建畜牧兽医. 2016(06)
[3]国内外真菌毒素检测方法研究现状及进展[J]. 张思思,陆继伟,王少敏,毛丹,苗水,季申. 食品安全质量检测学报. 2016(07)
[4]饲料中霉菌毒素的检测方法研究[J]. 范伟杰. 饲料工业. 2016(11)
[5]粮食中真菌毒素检测技术研究进展[J]. 陈云良. 食品安全导刊. 2016(12)
[6]低剂量玉米赤霉烯酮和吸附剂对育成期蛋鸡生长性能、血清生化指标和抗氧化指标的影响[J]. 伍宇超,杨维仁,杨在宾,姜淑贞,张桂国,姜新超. 动物营养学报. 2016(04)
[7]饲料中玉米赤霉烯酮检测及脱毒技术的研究进展[J]. 葛文霞,柳旭伟,张文举,刘晓娜. 安徽农业科学. 2016(01)
[8]玉米赤霉烯酮对猪生产的影响及其毒性吸附研究[J]. 陈继发,曲湘勇,彭灿阳,彭豫东. 动物营养学报. 2016(03)
[9]饲料及食品中玉米赤霉烯酮检测方法研究进展[J]. 任丹丹,谢云峰,李少晖,杨永坛. 分析测试技术与仪器. 2015(04)
[10]γ-射线降解玉米粉中玉米赤霉烯酮的效果及降解动力学研究[J]. 赵琳,张瑞英,兰静,金海涛,任红波,孙向东. 食品工业科技. 2016(07)
本文编号：3057838
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