基于VP0蛋白检测1型和3型DHAV抗体的间接ELISA的建立及应用
发布时间：2021-03-02 05:05
鸭病毒性肝炎（Duck Viral Hepatitis,DVH）是由鸭肝炎病毒（Duck Hepatitis virus,DHV）引起的雏鸭的一种急性、致死性疾病,由于其发病迅速且死亡率高,给养鸭业造成了巨大的经济损失。我国鸭病毒性肝炎主要是由DHAV-1和DHAV-3引起的,且比较常见的感染形式为两种型混合感染,因此急需一种操作简单、快速、成本低廉,且检出抗体全面的的检测方法。本研究首先以实验室保存的携带1型和3型VP0/VP3/VP1的重组质粒pMD18T-DHAV-1-1/2和pMD18T-DHAV3-1/2为模板,通过PCR扩增得到DHAV-1/3-VP0、DHAV-1/3-VP3和DHAV-1/3-VP1目的基因,将其克隆至pET-30a（+）和pET-32a（+）原核表达载体中,进行蛋白的原核表达,获得了Rosetta-pET30a-DHAV1/3-VP0、Rosetta-pET32a-DHAV1/3-VP1和Rosetta-pET30a-DHAV1/3-VP3重组蛋白。以纯化后的重组蛋白为抗原,利用Western Blot分别与同型和异型的鸭血清抗体进行免疫反应性分析,结...
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
鸭肝炎病毒基因组结构示意图
结果与分析表 3-14 特异性反应试验结果Table 3-14 The results of intercross test for ELISA抗体Antibody鸭病毒性肠炎DEV鸭源小鹅瘟GPV禽流感H9N2 亚型鸭坦布苏DTMUVDHAV-1 阳性对照DHAV-1PositivecontroDHAV-3 阳性对照DHAV-3Positivecontrol阴性对照NegativecontrolOD450nm0.202 0.214 0.126 0.109 1.298 0.985 0.192判定结果 - - - - + + -3.5 敏感性试验DHAV-1 和 DHAV-3 血清各 3 份，分别选择抗体水平较强的、较弱的及阴性血清三种进行检测，将血清从 1:20 起进行倍比稀释，其余条件按最佳反应条件进行 ELISA 检测，检测结果间图 3-10。结果表明，检测 DHAV-1 血清，最低检出量为 1:640，结果见图 A；检测 DHAV-3血清，最低检出量为 1:320，结果如图 B，综上所述，本研究建立的方法的最低检出量为 1:320。
东北农业大学农学硕士学位论文体水平逐渐下降，到二免十二周时，鸭体内抗体水平呈弱阳性，而后对母鸭进行第，到三免 4 周母鸭体内抗体水平呈现逐渐上升的趋势。免疫 3 型 DHAV 的成年母鸭抗体水平上升的比较缓慢，首免第 2 周抗体水平开始转阳，二免后母鸭体内抗体水升，到第 6 周达到最高峰，峰值为 1.075，而后抗体水平逐渐下降，到二免十二周内抗体水平呈弱阳性状态，而后进行第三次免疫，三免后到三免第 4 周，母鸭体内一直逐渐上升。免疫 1 型 DHAV 的鸭体内抗体水平强于免疫 3 型 DHAV 的鸭体内抗体抗体的变化趋势相似，见图 3-11。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于VP0蛋白的用以检测1型鸭甲肝病毒抗体的间接ELISA的建立和应用[J]. 齐晓燕,程安春,汪铭书,陈舜,贾仁勇,朱德康,刘马峰,刘菲,杨乔,孙昆峰,陈孝跃. 中国兽医科学. 2015(12)
[2]鸭1型甲肝病毒亚型VP3基因的克隆与原核表达[J]. 黄剑梅,傅秋玲,傅光华,万春和,陈翠腾,陈珍,程龙飞,施少华,陈红梅,黄瑜. 福建农业学报. 2015(05)
[3]基因C型鸭甲肝病毒竞争ELISA抗体检测方法的建立[J]. 何美琳,张焕容,程方明,杨晓农,岳华. 中国预防兽医学报. 2015(03)
[4]Ⅰ型鸭肝炎病毒基因C型株的分离与鉴定[J]. 张雪,龚文孝,胡勇,邹忠,李冉,金梅林. 动物医学进展. 2015(01)
[5]基于基因C型鸭甲肝病毒VP1重组蛋白的鸭甲肝病毒抗体ELISA检测方法的建立[J]. 杨发龙,张焕容,程方明,岳华,汤承. 畜牧兽医学报. 2014(07)
[6]一起鸭甲肝病毒1型和3型混合感染的研究报道[J]. 孙晓军,任建亭,刘金凤,杨胜富,马秀丽. 家禽科学. 2014(07)
[7]鸭甲肝病毒3型2012年山东分离株VP1基因的序列分析[J]. 徐倩,陈琳琳,张瑞华,杨蕾,谢之景,朱岩丽,姜世金,司兴奎. 病毒学报. 2013(05)
[8]鸭病毒性肝炎病毒高免卵黄抗体的免疫攻毒保护试验[J]. 陈贤德,汪洋. 黑龙江畜牧兽医. 2013(12)
[9]新型鸭肝炎病毒GD1株VP1结构蛋白的基因分析及B细胞抗原表位预测[J]. 范卫国,杜佳慧,曹瑞兵,陈溥言. 畜牧与兽医. 2011(01)
[10]鸭肝炎病毒分子流行病学分析[J]. 袁率珍,范书才,李虹,姜畔,张兵. 中国预防兽医学报. 2010(11)
硕士论文
[1]基于密码子优化的VP1基因表达蛋白检测1型和3型鸭甲肝病毒抗体的胶体金试纸条[D]. 卿莉.四川农业大学 2016
[2]1型鸭甲肝病毒VP3蛋白间接ELISA方法的建立及其B细胞表位鉴定[D]. 沈友林.四川农业大学 2015
[3]鸭甲肝病毒1型和3型抗体间接ELISA检测方法的建立与应用[D]. 张玉瑶.山东农业大学 2015
[4]I型鸭肝炎病毒VP1蛋白的表达纯化及单克隆抗体的制备[D]. 张婷婷.东北农业大学 2011
[5]鸭肝炎病毒抗原性鉴定及相关基因分析[D]. 袁率珍.中国兽医药品监察所 2010
[6]Ⅰ型鸭肝炎病毒LY0801株的分离鉴定及致病性研究[D]. 高继明.山东农业大学 2009
[7]鸭肝炎病毒单克隆抗体的制备及初步应用[D]. 杨萍萍.山东农业大学 2004
[8]鸭肝炎病毒免疫种鸭抗体消长规律及其雏鸭母源抗体变化的研究[D]. 樊景凤.东北农业大学 2000
本文编号：3058664
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
鸭肝炎病毒基因组结构示意图
结果与分析表 3-14 特异性反应试验结果Table 3-14 The results of intercross test for ELISA抗体Antibody鸭病毒性肠炎DEV鸭源小鹅瘟GPV禽流感H9N2 亚型鸭坦布苏DTMUVDHAV-1 阳性对照DHAV-1PositivecontroDHAV-3 阳性对照DHAV-3Positivecontrol阴性对照NegativecontrolOD450nm0.202 0.214 0.126 0.109 1.298 0.985 0.192判定结果 - - - - + + -3.5 敏感性试验DHAV-1 和 DHAV-3 血清各 3 份，分别选择抗体水平较强的、较弱的及阴性血清三种进行检测，将血清从 1:20 起进行倍比稀释，其余条件按最佳反应条件进行 ELISA 检测，检测结果间图 3-10。结果表明，检测 DHAV-1 血清，最低检出量为 1:640，结果见图 A；检测 DHAV-3血清，最低检出量为 1:320，结果如图 B，综上所述，本研究建立的方法的最低检出量为 1:320。
东北农业大学农学硕士学位论文体水平逐渐下降，到二免十二周时，鸭体内抗体水平呈弱阳性，而后对母鸭进行第，到三免 4 周母鸭体内抗体水平呈现逐渐上升的趋势。免疫 3 型 DHAV 的成年母鸭抗体水平上升的比较缓慢，首免第 2 周抗体水平开始转阳，二免后母鸭体内抗体水升，到第 6 周达到最高峰，峰值为 1.075，而后抗体水平逐渐下降，到二免十二周内抗体水平呈弱阳性状态，而后进行第三次免疫，三免后到三免第 4 周，母鸭体内一直逐渐上升。免疫 1 型 DHAV 的鸭体内抗体水平强于免疫 3 型 DHAV 的鸭体内抗体抗体的变化趋势相似，见图 3-11。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于VP0蛋白的用以检测1型鸭甲肝病毒抗体的间接ELISA的建立和应用[J]. 齐晓燕,程安春,汪铭书,陈舜,贾仁勇,朱德康,刘马峰,刘菲,杨乔,孙昆峰,陈孝跃. 中国兽医科学. 2015(12)
[2]鸭1型甲肝病毒亚型VP3基因的克隆与原核表达[J]. 黄剑梅,傅秋玲,傅光华,万春和,陈翠腾,陈珍,程龙飞,施少华,陈红梅,黄瑜. 福建农业学报. 2015(05)
[3]基因C型鸭甲肝病毒竞争ELISA抗体检测方法的建立[J]. 何美琳,张焕容,程方明,杨晓农,岳华. 中国预防兽医学报. 2015(03)
[4]Ⅰ型鸭肝炎病毒基因C型株的分离与鉴定[J]. 张雪,龚文孝,胡勇,邹忠,李冉,金梅林. 动物医学进展. 2015(01)
[5]基于基因C型鸭甲肝病毒VP1重组蛋白的鸭甲肝病毒抗体ELISA检测方法的建立[J]. 杨发龙,张焕容,程方明,岳华,汤承. 畜牧兽医学报. 2014(07)
[6]一起鸭甲肝病毒1型和3型混合感染的研究报道[J]. 孙晓军,任建亭,刘金凤,杨胜富,马秀丽. 家禽科学. 2014(07)
[7]鸭甲肝病毒3型2012年山东分离株VP1基因的序列分析[J]. 徐倩,陈琳琳,张瑞华,杨蕾,谢之景,朱岩丽,姜世金,司兴奎. 病毒学报. 2013(05)
[8]鸭病毒性肝炎病毒高免卵黄抗体的免疫攻毒保护试验[J]. 陈贤德,汪洋. 黑龙江畜牧兽医. 2013(12)
[9]新型鸭肝炎病毒GD1株VP1结构蛋白的基因分析及B细胞抗原表位预测[J]. 范卫国,杜佳慧,曹瑞兵,陈溥言. 畜牧与兽医. 2011(01)
[10]鸭肝炎病毒分子流行病学分析[J]. 袁率珍,范书才,李虹,姜畔,张兵. 中国预防兽医学报. 2010(11)
硕士论文
[1]基于密码子优化的VP1基因表达蛋白检测1型和3型鸭甲肝病毒抗体的胶体金试纸条[D]. 卿莉.四川农业大学 2016
[2]1型鸭甲肝病毒VP3蛋白间接ELISA方法的建立及其B细胞表位鉴定[D]. 沈友林.四川农业大学 2015
[3]鸭甲肝病毒1型和3型抗体间接ELISA检测方法的建立与应用[D]. 张玉瑶.山东农业大学 2015
[4]I型鸭肝炎病毒VP1蛋白的表达纯化及单克隆抗体的制备[D]. 张婷婷.东北农业大学 2011
[5]鸭肝炎病毒抗原性鉴定及相关基因分析[D]. 袁率珍.中国兽医药品监察所 2010
[6]Ⅰ型鸭肝炎病毒LY0801株的分离鉴定及致病性研究[D]. 高继明.山东农业大学 2009
[7]鸭肝炎病毒单克隆抗体的制备及初步应用[D]. 杨萍萍.山东农业大学 2004
[8]鸭肝炎病毒免疫种鸭抗体消长规律及其雏鸭母源抗体变化的研究[D]. 樊景凤.东北农业大学 2000
本文编号：3058664
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