激活素A通过TGFβ/SMAD信号通路促进鸡原始生殖细胞增殖
发布时间：2021-03-03 07:42
原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）是一类具有分化潜能的生殖细胞。为了检测激活素A（activin A）对鸡胚血液PGCs体外存活和增殖的影响,本研究从第1315期鸡胚血液中分离提取PGCs,并进行鉴定;在完全培养液中分别添加0和100 ng/m L activin A培养48 h后,检测PGCs数目、形态及细胞周期;检测Dazl（deleted in azoospermia-like）基因甲基化水平;并通过Western blot检测转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）信号通路中TGF-β、SMAD2/3的表达和磷酸化变化。结果显示,从鸡胚血液中分离的PGCs,经过红细胞裂解液处理和传代后,可获得高纯度PGCs,且具有良好的生长趋势。培养的PGCs呈阶段特异性胚胎抗原（stage specific embryonic antigen 1,SSEA-1）、鸡（Gallus gallus）VASA同源基因（chicken vasa homologue,CVH）免疫染色和过碘酸希夫（p...
【文章来源】：农业生物技术学报. 2017,25(04)北大核心
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
鸡胚血液PGCs的鉴定Figure2IdentificationofchickenembryonicbloodPGCs
觳鈇ctivinA对PGCs增殖的作图2鸡胚血液PGCs的鉴定Figure2IdentificationofchickenembryonicbloodPGCsA.SSEA-1免疫荧光染色，阳性；B.CVH免疫荧光染色，阳性；C.PAS反应，阳性；D.PGCs分子标记的qRT-PCR检测。M：DL500markerA.ImmunofluencestainingofSSEA-1withpositiveresult;B.ImmunofluencestainingofCVHwithpositiveresult;C.PASstain-ingwithpositiveresult.D.qRT-PCRanalysisofPGCs.M:DL500marker20μm20μm20μm20μm20μm20μm→→→→→→ABCDEF图1鸡胚血液PGCs的形态Figure1MorphologyofchickenembryonicbloodPGCsculturedinvitroA~B.刚分离出来的PGCs；C~D.经ACK处理后的PGCs；E~F.培养7d的PGCs。→：PGCs；：成纤维细胞；：血红细胞A~B.PGCsfreshlyisolatedfromstage13~15embryos;C~D.PGCsafterACKprocession;E~F.CultureofbloodPGCsfor7days.→:PGCs;:Fibroblasts;:Bloodcells542
图4激活素A对鸡胚PGCs细胞周期的影响Figure4EffectofactivinAoncellcycleofPGCsA.对照组；B.100ng/mL激活素A处理组；C.激活素A对细胞周期蛋白基因表达的影响。Cyclin：细胞周期蛋白；CDK：细胞周期蛋白依赖性激酶；内参基因：β-actin，n=3；*：差异显著(P＜0.05)，下同A.Controlgroup;B.100ng/mLactivinAtreatmentgroup;C.TheeffectofactivinAonexpressionofcellcycleregulatinggenes.CDK:Cyclin-dependentkinases;Referefcegene:β-actin,n=3;*:Significantdifference(P＜0.05),thesamebelow图3激活素A对鸡胚血液PGCs细胞增殖的影响Figure3TheeffectofActivinAontheproliferationofchickenembryonicbloodPGCsA.对照组；B.PGCs经过100ng/mL激活素A处理48h后的细胞形态；C.PGCs细胞数目统计。**：差异极显著(P＜0.01)A.Controlgroup;B.MorphologyofPGCstreatedwith100ng/mLactivinAfor48h.C.StatisticsanalysisofPGCsnumber.**:Extremelysignificantdifference(P＜0.01)ABC50μ50mμm用，通过qRT-PCR对细胞周期调控相关基因CDK2/CyclinD1和CDK6/CyclinE进行了检测，细胞周期蛋白及蛋白激酶在细胞从G1期向S期转变过程中，起着至关重要的调控作用，其表达水平反映了细胞的增殖状态。结果显示，100ng/mLactivinA显著上调了CDK2/CyclinD1和CDK6/CyclinE的表达水平(P＜0.05)(图4C)，进一步说明ac-tivinA能加速细胞有丝分裂周期，促进鸡胚血液PGCs的增殖。2.5activinA对PGCs中Dazl甲基化的影响通过亚硫酸测序的方法检测activinA处理对Dazl基因DNA甲基化的影响。电泳结果显示，引物特异性很好，可用于进一步实验(图5A)，结果发现，Dazl基因的甲基化位点变化明显，对照组处于高甲基化状态，而activinA处理后甲基化程度显著降?
【参考文献】：
期刊论文
[1]cNanog和cPouV表达下调对鸡胚胎干细胞（cESCs）多能性的影响[J]. 陈志胜,彭特,陈胜锋,李东升,计慧琴,王丙云,陈金顶. 农业生物技术学报. 2014(08)
本文编号：3060891
【文章来源】：农业生物技术学报. 2017,25(04)北大核心
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
鸡胚血液PGCs的鉴定Figure2IdentificationofchickenembryonicbloodPGCs
觳鈇ctivinA对PGCs增殖的作图2鸡胚血液PGCs的鉴定Figure2IdentificationofchickenembryonicbloodPGCsA.SSEA-1免疫荧光染色，阳性；B.CVH免疫荧光染色，阳性；C.PAS反应，阳性；D.PGCs分子标记的qRT-PCR检测。M：DL500markerA.ImmunofluencestainingofSSEA-1withpositiveresult;B.ImmunofluencestainingofCVHwithpositiveresult;C.PASstain-ingwithpositiveresult.D.qRT-PCRanalysisofPGCs.M:DL500marker20μm20μm20μm20μm20μm20μm→→→→→→ABCDEF图1鸡胚血液PGCs的形态Figure1MorphologyofchickenembryonicbloodPGCsculturedinvitroA~B.刚分离出来的PGCs；C~D.经ACK处理后的PGCs；E~F.培养7d的PGCs。→：PGCs；：成纤维细胞；：血红细胞A~B.PGCsfreshlyisolatedfromstage13~15embryos;C~D.PGCsafterACKprocession;E~F.CultureofbloodPGCsfor7days.→:PGCs;:Fibroblasts;:Bloodcells542
图4激活素A对鸡胚PGCs细胞周期的影响Figure4EffectofactivinAoncellcycleofPGCsA.对照组；B.100ng/mL激活素A处理组；C.激活素A对细胞周期蛋白基因表达的影响。Cyclin：细胞周期蛋白；CDK：细胞周期蛋白依赖性激酶；内参基因：β-actin，n=3；*：差异显著(P＜0.05)，下同A.Controlgroup;B.100ng/mLactivinAtreatmentgroup;C.TheeffectofactivinAonexpressionofcellcycleregulatinggenes.CDK:Cyclin-dependentkinases;Referefcegene:β-actin,n=3;*:Significantdifference(P＜0.05),thesamebelow图3激活素A对鸡胚血液PGCs细胞增殖的影响Figure3TheeffectofActivinAontheproliferationofchickenembryonicbloodPGCsA.对照组；B.PGCs经过100ng/mL激活素A处理48h后的细胞形态；C.PGCs细胞数目统计。**：差异极显著(P＜0.01)A.Controlgroup;B.MorphologyofPGCstreatedwith100ng/mLactivinAfor48h.C.StatisticsanalysisofPGCsnumber.**:Extremelysignificantdifference(P＜0.01)ABC50μ50mμm用，通过qRT-PCR对细胞周期调控相关基因CDK2/CyclinD1和CDK6/CyclinE进行了检测，细胞周期蛋白及蛋白激酶在细胞从G1期向S期转变过程中，起着至关重要的调控作用，其表达水平反映了细胞的增殖状态。结果显示，100ng/mLactivinA显著上调了CDK2/CyclinD1和CDK6/CyclinE的表达水平(P＜0.05)(图4C)，进一步说明ac-tivinA能加速细胞有丝分裂周期，促进鸡胚血液PGCs的增殖。2.5activinA对PGCs中Dazl甲基化的影响通过亚硫酸测序的方法检测activinA处理对Dazl基因DNA甲基化的影响。电泳结果显示，引物特异性很好，可用于进一步实验(图5A)，结果发现，Dazl基因的甲基化位点变化明显，对照组处于高甲基化状态，而activinA处理后甲基化程度显著降?
【参考文献】：
期刊论文
[1]cNanog和cPouV表达下调对鸡胚胎干细胞（cESCs）多能性的影响[J]. 陈志胜,彭特,陈胜锋,李东升,计慧琴,王丙云,陈金顶. 农业生物技术学报. 2014(08)
本文编号：3060891
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