2A肽介导的三荧光基因共表达系统在转基因羊中的表达及其DNA甲基化初步研究

发布时间：2021-03-03 16:50

　　随着社会经济和科学研究的发展，多基因共表达技术在生物医药和农业生产中的作用越来越重要。目前，常用的多基因共表达方法有内核糖体进入位点（IRES）元件载体、双向或双启动子共表达、多个质粒共转染及多病毒载体共感染等。但是这些方法都遇到了多基因共表达不平衡及表达量不足的问题，如IRES下游基因的表达对其在IRES之后的特异定位敏感，有可能造成表达沉默，或下游蛋白的表达水平远低于同一开放阅读框中上游蛋白的表达水平。2A肽则能够改善以上缺陷。2A肽属于cis-水解酶作用元件（CHYSELs），多基因载体在2A肽调控下各基因可独立表达。与IRES相比，2A肽序列短（54-90bp）、能够调节多基因独立表达且表达效率高，具有其它多基因共表达技术无可比拟的优点。目前，大多数转基因动物的制备均以单基因表达为目标，而多基因共表达制备转基因动物的研究较少。利用2A肽生产多基因修饰动物已在小鼠和猪上报道，但在绵羊上未见报道。慢病毒载体转基因技术是目前家畜生产中效率最高的转基因技术，2A肽介导的多基因共表达与慢病毒载体相结合制备转基因动物，具有转基因效率高、多基因同时表达的特点。在一个转基因动物上同时表达多个功... 

【文章来源】：石河子大学新疆维吾尔自治区 211工程院校

【文章页数】：125 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
英文摘要
中英文对照表
第一章 文献综述
    1 2A肽在生物医药和生物技术中的研究进展
        1.1 2A肽的起源
        1.2 常见的2A肽及类2A肽序列
        1.3 2A肽的作用机制
        1.4 2A肽介导的蛋白的亚细胞定位
        1.5 2A肽的作用效率
        1.6 2A肽的应用
        1.7 多基因共表达构建策略
        1.8 慢病毒多基因共表达载体
        1.9 前景
    2 DNA甲基化在动物中的研究进展
        2.1 DNA甲基化的表型特征
        2.2 DNA甲基化作用机制
        2.3 DNA甲基化调控信号
        2.4 DNA甲基化的分析方法
        2.5 DNA甲基化调节因子
        2.6 DNA甲基化抑制剂
        2.7 DNA甲基化与染色质相关性
        2.8 组蛋白修饰
        2.9 组蛋白去乙酰化酶抑制剂
        2.10 甲基化在家畜中的研究现状
第二章 三荧光基因共表达载体pLEX-2A-TYG的构建及其在真核细胞中的表达
    1 实验材料
        1.1 本实验使用的载体
        1.2 本实验使用的细胞株
        1.3 本实验主要试剂
        1.4 本实验主要仪器
        1.5 主要试剂的配制
    2 实验方法
        2.1 2A-linker的构建
        2.2 引物的设计
        2.3 多聚酶链式反应（PCR）
        2.4 限制性酶酶切实验
        2.5 连接反应
        2.6 克隆转化
        2.7 阳性重组子的筛选鉴定9
        2.8 胶回收实验9
        2.9 细胞的培养10
        2.10 质粒的提取
        2.11 质粒转染实验
        2.12 荧光显微镜检测12
        2.13 Western blotting检测
    3 结果
        3.1 2A肽-linker片段的获取
        3.2 质粒pacGFP1-N1的改造
        3.3 质粒ptdtomato-2A和pzsYellow1-2A的获得
        3.4 质粒ptdTomato-acGFP1和质粒pzsYellow1-acGFP1的获得
        3.5 质粒p2A-TYG的获得
        3.6 质粒pLEX-2A-TYG的获得
        3.7 质粒转染的荧光检测
        3.8 Western blotting检测结果
    4 讨论
        4.1 Kozak consensus sequence
        4.2 2A肽介导的多基因载体在细胞中表达
        4.3 酶切位点的保护碱基
        4.4 多基因载体中三荧光蛋白基因的表达检测结果分析
第三章 慢病毒的包装及滴毒检测
    1 实验材料和方法
        1.1 实验细胞株
        1.2 实验所用载体
        1.3 实验主要试剂
        1.4 主要试剂的配制
        1.5 主要实验仪器
    2 实验方法
        2.1 细胞的培养
        2.2 重组质粒的大量提取
        2.3 病毒的包装
        2.4 慢病毒滴度的测定
        2.5 慢病毒的感染
        2.6 单克隆细胞的筛选
        2.7 激光共聚焦检测
    3 结果
        3.1 质粒的质量和浓度检测
        3.2 包装病毒的滴度检测
        3.3 单克隆细胞的筛选及检测
    4 讨论
        4.1 慢病毒载体特点
        4.2 慢病毒的包装
        4.3 病毒的浓缩
        4.4 病毒滴度的测定
        4.5 提高病毒载体体外感染的能力
        4.6 实验室安全措施
第四章 转基因羊的生产和检测
    1 实验材料
        1.1 实验动物
        1.2 实验试剂
        1.3 主要试剂的配制
        1.4 主要仪器
    2 实验方法
        2.1 转基因羊的生产
        2.2 转基因羊尾组织 DNA 的提取
        2.3 转基因羊的 PCR 检测
        2.4 Western blotting 检测
        2.5 基因组 DNA Southern blotting
        2.6 RT-PCR 检测
        2.7 DNA 甲基化分析
        2.8 CMV 启动子转录因子结合位点分析
        2.9 统计分析
    3 结果
        3.1 三色荧光蛋白基因共表达慢病毒转基因羊的生产情况
        3.2 转基因羊的整合检测结果
        3.3 转基因羊甲基化分析
        3.4 CMV启动子转录因子结合位点分析结果 50
    4 讨论
        4.1 慢病毒载体在转基因动物中的应用
        4.2 2A肽在慢病毒介导的生物技术中的应用
        4.3 转基因羊DNA甲基化分析
        4.4 DNA甲基化检测方法
        4.5 CMV启动子转录因子结合位点
第五章 转基因羊内外源基因 DN A 甲基化机制初步研究
    1 材料和方法
        1.1 实验试剂
        1.2 实验材料
        1.3 实验仪器
        1.4 主要试剂的配制
    2 实验方法
        2.1 成纤维细胞的分离
        2.2 成纤维细胞的纯化
        2.3 纤维细胞的培养
        2.4 转基因成纤维细胞的药物处理实验
        2.5 荧光显微镜检测
        2.6 流式细胞术检测
        2.7 统计分析
    3 结果
        3.1 成纤维细胞的分离和纯化
        3.2 TSA和5-azaC对成纤维细胞表观状态的影响
        3.3 流式细胞术检测结果
    4 讨论
        4.1 转基因表达的影响因素
        4.2 DN A 甲基化转移酶抑制剂-5-azaC
        4.3 去乙酰化酶抑制剂 - TSA
        4.4 流式细胞术检测
第六章 小结、创新点、展望
    1 小结
    2 创新点
    3 展望
参考文献
附录
作者简介
致谢
导师评阅表


【参考文献】：
期刊论文
[1]Production of Transgenic Korean Native Cattle Expressing Enhanced Green Fluorescent Protein Using a FIV-Based Lentiviral Vector Injected into MII Oocytes[J]. Yong-Nan Xu,Sang-Jun Uhm,Bon-Chul Koo,Mo-Sun Kwon,Ji-Yeol Roh,Jung-Seok Yang,Hyun-Yong Choi,Young-Tae Heo,Xiang-Shun Cui,Joon-Ho Yoon,Dae-Hwan Ko,Teoan Kim,Nam-Hyung Kim.  遗传学报. 2013(01)
[2]DNA methylation and microRNAs in cancer[J]. Xiang-Quan Li,Yuan-Yuan Guo,Wei De,Department of Biochemistry and Molecular Biology,Nanjing Medical University,Nanjing 210029,Jiangsu Province,China.  World Journal of Gastroenterology. 2012(09)
[3]“自我剪切”2A肽介导的Δ-12和ω-3脂肪酸脱氢酶以及过氧化氢酶在转基因小鼠肌肉表达研究[J]. 方锐,彭云乾,郑敏,孟庆勇.  生物化学与生物物理进展. 2012(02)
[4]卵周隙内注射慢病毒生产转基因绵羊的方法[J]. 汪立芹,刘晨曦,王静,黄俊成.  中国实验动物学报. 2011(01)
[5]崂山奶山羊乳腺中孕激素受体基因甲基化与基因表达关系的研究[J]. 荣美洁,李兰,董文娟,闵令江,潘庆杰.  青岛农业大学学报(自然科学版). 2010(03)
[6]荣昌猪仔猪性别间DNA甲基化水平的差异研究[J]. 白小青,王金勇,陈英,潘红梅,刘文,李军峰.  中国畜牧杂志. 2010(13)
[7]绵羊Cdkn1c的DNA甲基化分析[J]. 赵丽霞,赵高平,郭荣启,王丙萍,周欢敏.  中国畜牧兽医. 2010(04)
[8]牛4种组织中ZAR1基因表达及DNA甲基化修饰[J]. 辛鹏慧,岳永莉,李燕,于海泉.  畜牧与兽医. 2009(10)
[9]绵羊耳成纤维细胞的体外培养[J]. 李桂芳,李岩,赵宗胜,李大全.  中国草食动物. 2003(04)



本文编号：3061595