弓形虫疫苗候选抗原IMP1生物学特性及其免疫原性研究

发布时间：2021-03-05 12:58

　　弓形虫是一种专性细胞内寄生繁殖的机会性致病病原体,可以感染包括人在内的几乎所有的温血动物,严重威胁人类及动物健康。正常人感染弓形虫后,大多数不表现出明显的临床症状,呈隐性感染状态,但对婴儿或机体免疫力低下或免疫抑制时（AIDS、骨髓移植、器官移植等）可表现出严重的临床症状,甚至可以引起死亡。妊娠期母畜感染该病,常可引起流产,死产,木乃伊胎以及其它一些严重的临床症状,造成严重的经济损失。目前,对于弓形虫病的防治仍以预防为主,无特效药物。因此,研发切实有效的疫苗是防治的关键。IMP1蛋白是2011年刚发现的蛋白,被认为在弓形虫病疫苗开发方面具有重要潜力。本研究通过分子生物学、基因工程学、免疫生物学等方法对弓形虫IMP1的表达特性及免疫原性进行研究,探讨IMP1及其相关蛋白的功能,为弓形虫病防控提供新的思路与方法。1.浙江省动物弓形虫病血清流行病学调查为了解浙江省动物弓形虫病的流行现状,更好地为弓形虫病的防治提供科学的依据,本项目组成员采集了来自浙江省十一地市的813份猪血清、70份奶牛血清、151份山羊血清、213份犬血清及60份猫血清样品,进行了弓形虫病的血清流行病学调查。结果表明,猪的... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：136 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
前言
第一部分 文献综述
    第一章 弓形虫与弓形虫病
        1 弓形虫病原形态
        2 弓形虫生活史
        3 弓形虫的抵抗力
        4 弓形虫流行病学
            4.1 检测方法
            4.2 流行情况
        5 弓形虫病的防治
        6 小结
    第二章 弓形虫毒力因子研究进展
        1 基因型与毒力
        2 弓形虫滑行运动和粘附,入侵及逸出宿主细胞过程相关毒力因子
            2.1 稳定的表膜蛋白和脂肪
            2.2 棒状体颈部蛋白：RONs
            2.3 棒状体球部蛋白
            2.4 瞬时表膜蛋白：MICs
            2.5 弓形虫与宿主细胞互作相关毒力因子
            2.6 其它因子
        3 参与虫体发育及转化的毒力因子
            3.1 致密颗粒
            3.2 细胞骨架
        4 包囊形成和虫荷
        5 小结
    第三章 弓形虫疫苗研究进展
        1 弓形虫疫苗防治机制
        2 弓形虫疫苗研究现状
            2.1 弓形虫虫体抗原
            2.2 亚单位疫苗
            2.3 核酸疫苗
        3 小结
第二部分 研究内容
    第四章 浙江省动物弓形虫病血清流行病学调查
        摘要
        1 材料与方法
            1.1 主要材料试剂与仪器
            1.2 样品的采集
            1.3 样品的检测
            1.4 数据分析
        2 结果
            2.1 浙江省猪、奶牛、山羊、犬、猫弓形虫血清阳性率
            2.2 浙江省猪弓形虫流行病学相关风险因子分析
            2.3 浙江省犬弓形虫流行病学相关风险因子分析
            2.4 浙江省猫弓形虫流行病学相关风险因子分析
        3 讨论
    第五章 基于SAG1基因弓形虫荧光定量PCR检测方法的建立
        摘要
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 参考虫株、模板和实验动物
                1.1.2 主要试剂与仪器
                1.1.3 溶液配制
            1.2 方法
                1.2.1 弓形虫基因组DNA的制备
                1.2.2 引物设计
                1.2.3 普通PCR
                1.2.4 定量PCR扩增
                1.2.5 荧光定量PCR特异性试验
                1.2.6 荧光定量PCR敏感性试验
                1.2.7 荧光定量PCR稳定性及重复性试验
                1.2.8 临床样品的检测
        2 结果
            2.1 阳性质粒pMD-SAG1的构建
            2.2 荧光定量PCR扩增产物的鉴定
            2.3 荧光定量PCR标准曲线的建立
            2.4 荧光定量PCR特异性试验结果
            2.5 敏感性试验结果
            2.6 荧光定量PCR的重复性试验结果
            2.7 临床样品检测结果
        3 讨论
    第六章 弓形虫IMP1的表达特性研究
        摘要
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 参考虫株和实验动物
                1.1.2 菌株与质粒
                1.1.3 工具酶与试剂
                1.1.4 主要仪器设备
                1.1.5 溶液配制
            1.2 方法
                1.2.1 引物设计
                1.2.2 弓形虫速殖子总RNA的提取
                1.2.3 cDNA第一链的合成
                1.2.4 弓形虫IMP1基因的RT-PCR扩增
                1.2.5 弓形虫IMP1基因的克隆
                1.2.6 测序分析
                1.2.7 弓形虫IMP1原核表达载体的构建
                1.2.8 弓形虫IMP1的原核表达
                1.2.9 SDS-PAGE
                1.2.10 Western blot鉴定
                1.2.11 目的蛋白的纯化与复性
                1.2.12 多克隆抗体的制备
                1.2.13 间接ELISA法检测抗体水平
                1.2.14 Vero细胞及弓形虫的传代、培养
                1.2.15 游离速殖子IMP1的亚细胞定位
                1.2.16 入侵过程中速殖子IMP1的亚细胞定位
                1.2.17 入侵后纳虫空泡中速殖子IMP1的亚细胞定位
        2 结果
            2.1 PCR扩增结果
            2.2 弓形虫pET30a-IMP1质粒的PCR鉴定及酶切分析
            2.3 测序结果分析
            2.4 pET30a-IMP1的原核表达及Western-blot鉴定
            2.5 多克隆抗体效价的测定
            2.6 不同时期弓形虫IMP1蛋白的亚细胞定位
        3 讨论
    第七章 弓形虫二价重组亚单位疫苗rSAG1/IMP1的免疫原性研究
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
                1.1.1 弓形虫与试验动物
                1.1.2 菌株与质粒
                1.1.3 工具酶与试剂
                1.1.4 主要仪器设备
                1.1.5 溶液配制
            1.2 试验方法
                1.2.1 弓形虫基因组DNA的制备
                1.2.2 弓形虫IMP1、SAG1基因的扩增
                1.2.3 弓形虫IMP1及SAG1基因的克隆
                1.2.4 测序分析
                1.2.5 弓形虫SAG1-IMP1真核表达载体的构建
                1.2.6 IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白
                1.2.7 SDS-PAGE
                1.2.8 Western-blotting
                1.2.9 目的蛋白的纯化
                1.2.10 重组亚单位疫苗的免疫效果研究
        2 结果
            2.1 重组质粒pET30a-SAG1-IMP1的PCR鉴定
            2.2 重组质粒pET30a-SAG1-IMP1的测序结果
            2.3 rSAG1、rIMP1、rSAG-IMP1的表达纯化
            2.4 重组亚单位疫苗诱导的体液免疫应答
            2.5 抗体亚类的检测
            2.6 淋巴细胞转化试验
            2.7 胞因子的检测
            2.8 动物保护性试验
        3 讨论
    第八章 减毒沙门氏菌为载体传递弓形虫IMP1基因的免疫原性研究
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
                1.1.1 弓形虫与试验动物
                1.1.2 菌株与质粒
                1.1.3 工具酶与试剂
                1.1.4 主要仪器设备
                1.1.5 溶液配制
            1.2 试验方法
                1.2.1 弓形虫基因组DNA的制备
                1.2.2 弓形虫IMP1、SAG1基因的扩增
                1.2.3 弓形虫IMP1及SAG1基因的克隆
                1.2.4 测序分析
                1.2.5 弓形虫IMP1及SAG1-IMP1真核表达载体的构建
                1.2.6 电转用减毒沙门氏菌感受态的制备
                1.2.7 真核表达质粒电转化入沙门氏菌
                1.2.8 重组沙门氏菌中质粒的鉴定
                1.2.9 减毒沙门氏菌活载体核酸疫苗的免疫效果研究
        2 结果
            2.1 重组质粒pMD18-SAG1、pMD18-IMP1、pMD18-IMP1（融合）的PCR鉴定
            2.2 重组质粒pcDNA3.1-IMP1、pcDNA3.1-IMP1（融合）的PCR鉴定
            2.3 重组质粒pcDNA3.1-SAG1-IMP1的PCR鉴定
            2.4 重组质粒的测序结果
            2.5 活载体核酸疫苗诱导体液免疫应答
            2.6 抗体亚类的检测
            2.7 疫苗免疫对淋巴细胞增殖的影响
            2.8 细胞因子的检测
            2.9 动物保护性试验
        3 讨论
全文结论
论文创新性
研究展望
附录1 溶液配制
附录2 英文缩写注释
攻读博士学位期间的主要成果
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]浙江地区犬 猫 猪弓形虫病的流行病学调查[J]. 黄利权,李慧,何士根,毛红瑞.  中国兽医杂志. 2011(06)
[2]辽宁省盖州市绒山羊弓形虫病的血清学调查[J]. 任忠奎,王敏,赵虹霓,郭琦,刘岩松.  中国动物检疫. 2010(02)
[3]新疆猪、牛、羊弓形虫病的血清学调查[J]. 米晓云,巴音查汗,李文超.  中国兽医寄生虫病. 2007(02)
[4]弗氏佐剂与氢氧化铝佐剂对诱导小鼠获得性免疫应答作用的比较[J]. 潘萌,蒋浩琴,周芸,郑捷.  现代免疫学. 2006(02)
[5]上海市松江区家畜弓形虫病的流行病学调查[J]. 曹向英,朱骏,沈林辉,彭笑蓉,张慧英,孙文梅.  上海畜牧兽医通讯. 2006(01)
[6]规模猪场弓形虫病调查[J]. 朱织云,占松华,余有富,周元宝.  中国动物检疫. 2000(09)



本文编号：3065241