CRISPR/Cas9构建srtA基因敲除的金黄色葡萄球菌
发布时间：2021-03-06 00:11
利用CRISPR/Cas9技术构建耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300的srtA基因缺失株及回补株,分析其对菌株毒力的影响。设计3对srtA基因sgRNA,以pCasSA为载体,构建pCasSA-sgRNA质粒。经缺陷型金黄色葡萄球菌RN4220菌株修饰后,转入USA300中,检测pCasSA-sgRNA质粒的切割效率。扩增并融合srtA基因左右同源臂并将其插入pCasSA-sgRNA质粒中,构建敲除质粒pCasSA-sgRNA-srtA。敲除质粒经修饰,转入USA300中,筛选并鉴定获得srtA基因缺失株。比较分析srtA基因缺失后对USA300菌株生长,小鼠存活率、器官载菌量及其肾脏组织病理学变化差异。同时,以pLI50质粒为载体,构建回补质粒pLI50-srtA及回补株,验证不同菌株表型是否存在差异。经氯霉素筛选,获得2个基因缺失株。与野生型菌株相比,srtA基因缺失后不影响USA300菌株的生长,但显著降低感染小鼠的死亡率,心脏、肾脏载菌量及肾脏组织病变程度。经srtA基因回补后其功能得以恢复。成功建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300菌株srtA基因缺失株和回补株基因编辑方...
【文章来源】：生物技术通报. 2020,36(09)北大核心
【文章页数】：13 页
【部分图文】：
pCasSA-sgRNA质粒切割效率检测
质粒pCasSA为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌温度敏感性质粒,用于金黄色葡萄球菌的基因编辑(图谱见图1)。该质粒可以利用Bsa I位点插入sgRNA片段,靶向目标基因,利用Xho I和Xba I位点插入目标基因左右同源臂序列,进行同源修复,进而达到金黄色葡萄球菌基因敲除的目的。构建pCasSA-sgRNA质粒。使用限制性内切酶Bsa I对pCasSA质粒上的Bsa I位点进行特异性酶切,酶切体系为:pCasSA 30 μL、Bsa I 2 μL、10×NEBuffer 5 μL、ddH2O 13 μL。使用天根生化科技(北京)有限公司DNA纯化回收试剂盒进行酶切质粒的纯化回收。酶切回收的pCasSA质粒与退火后的双链sgRNA序列经T4 DNA连接酶16℃连接3 h。连接体系为:T4 DNA Ligase 1 μL、10×T4 DNA Ligase buffer 2 μL、退火后的双链sgRNA序列12 μL,酶切回收后的pCasSA质粒1 μL、ddH2O 4 μL。连接产物经热激转化至大肠杆菌感受态细胞Top10中。用50 mg/μL的卡那霉素筛选阳性克隆,30℃增菌后用,用sgRNA上游序列(sgRNA1-F,sgRNA2-F,sgRNA3-F)和sgRNA检测下游引物srtA-sgRNA-R进行PCR扩增。将获得的PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,阳性pCasSA-sgRNA质粒(pCasSA-sgRNA1,pCasSA-sgRNA2,pCasSA-sgRNA3)送公司测序。测序结果使用MegAlign软件进行分析比对。
小鼠经尾静脉接种2×108 CFU/mL的金黄色葡萄球菌后,对小鼠的生存率进行分析,结果如图9所示。WT USA300显著的引起了小鼠的死亡。srtA缺失后小鼠无死亡。srtA基因回补后,感染小鼠与WT USA300组的小鼠死亡情况基本一致,证明srtA基因回补后其功能基本恢复。2.9 金黄色葡萄球菌USA300 srtA基因缺失对器官组织内细菌数量的影响
本文编号：3066099
【文章来源】：生物技术通报. 2020,36(09)北大核心
【文章页数】：13 页
【部分图文】：
pCasSA-sgRNA质粒切割效率检测
质粒pCasSA为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌温度敏感性质粒,用于金黄色葡萄球菌的基因编辑(图谱见图1)。该质粒可以利用Bsa I位点插入sgRNA片段,靶向目标基因,利用Xho I和Xba I位点插入目标基因左右同源臂序列,进行同源修复,进而达到金黄色葡萄球菌基因敲除的目的。构建pCasSA-sgRNA质粒。使用限制性内切酶Bsa I对pCasSA质粒上的Bsa I位点进行特异性酶切,酶切体系为:pCasSA 30 μL、Bsa I 2 μL、10×NEBuffer 5 μL、ddH2O 13 μL。使用天根生化科技(北京)有限公司DNA纯化回收试剂盒进行酶切质粒的纯化回收。酶切回收的pCasSA质粒与退火后的双链sgRNA序列经T4 DNA连接酶16℃连接3 h。连接体系为:T4 DNA Ligase 1 μL、10×T4 DNA Ligase buffer 2 μL、退火后的双链sgRNA序列12 μL,酶切回收后的pCasSA质粒1 μL、ddH2O 4 μL。连接产物经热激转化至大肠杆菌感受态细胞Top10中。用50 mg/μL的卡那霉素筛选阳性克隆,30℃增菌后用,用sgRNA上游序列(sgRNA1-F,sgRNA2-F,sgRNA3-F)和sgRNA检测下游引物srtA-sgRNA-R进行PCR扩增。将获得的PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,阳性pCasSA-sgRNA质粒(pCasSA-sgRNA1,pCasSA-sgRNA2,pCasSA-sgRNA3)送公司测序。测序结果使用MegAlign软件进行分析比对。
小鼠经尾静脉接种2×108 CFU/mL的金黄色葡萄球菌后,对小鼠的生存率进行分析,结果如图9所示。WT USA300显著的引起了小鼠的死亡。srtA缺失后小鼠无死亡。srtA基因回补后,感染小鼠与WT USA300组的小鼠死亡情况基本一致,证明srtA基因回补后其功能基本恢复。2.9 金黄色葡萄球菌USA300 srtA基因缺失对器官组织内细菌数量的影响
本文编号：3066099
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