牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白特异性单域抗体的制备及鉴定
发布时间：2021-03-07 08:15
牛传染性鼻气管炎（Infections bovine rhinotracheitis,IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infections bovine rhinotracheitis virus,IBRV）引起。一般情况下 IBRV 容易发生反复感染,导致本病难以清除,严重危害养牛业。目前,疫苗免疫是防治IBR的主要措施,但灭活疫苗不能引起长期持续的体液免疫,弱毒疫苗有残余毒力和返强等危险。为了有效防控IBR,需要开发有效的诊断用抗体。本试验研究通过克隆IBRV gD基因,连接原核表达载体,转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达,纯化及鉴定,获得IBRV-gD蛋白;然后以IBRV为抗原免疫成年健康双峰驼,采集全血,提取淋巴细胞总RNA,将其反转录后,扩增VHH基因片段并与载体pCANTAB5E连接,将其转化至大肠杆菌TG1感受态内,成功构建IBRV VHH抗体库。经过鉴定IBRV抗体库库容为7×107。经菌落鉴定,IBRV抗体库转化效率为75%。以gD蛋白作为筛选抗原,利用噬菌体展示技术,从IBRV VHH抗体库内进行筛选,并选取了相对结合能力较强的一株阳性克隆（IB68）,构建表达载体...
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１?ｇＤ基因ＰＣＲ扩增结果??
图２?ＩＢＲＶ?ｇＤ诱导表达结果??Ｆｉｇ?２?ＩＢＲＶ?ｇＤ?ｉｎｄｕｃｅｄ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ??注：Ａ：?ＬａｎｃＭ：?Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍａｒｋｅｒ，Ｌａｎｅｌ：末诱导的菌液，Ｌａｎｅ２：菌体破碎?ｈ清，Ｌａｎｃ３：菌沉淀，Ｌａｎｅ４：?ｇＤ蛋ｆｔ纯化流穿液，Ｌａｎｅ５－６：?ｇＤ蛋白纯化产物??Ｂ：?ＬａｎｅＭ：?Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ?ｐｒｏｔｏｉｎ?ｍａｒｋｅｒ，?Ｌａｎｅｌ：?ｇＤ?蛋ｆｔ?Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ?条带??２．?４讨论??ＩＢＲ给全球的养牛业带来巨大的经济损失，世界动物卫生组织曾将其列为Ｂ病，也是我国入境动物必检疫病之一。??虽然接种传统疫苗，可以产生的免疫效果，控制发病，抑制病毒的复制和传但是，ｆｆｉＲＶ并不能彻底的被机体免疫力清除，而是转为隐形感染。尽管如此，扑杀的成本太高，接种疫苗还是大部分国家防控的主要措施［５〇］。ＩＢＲＶ感染后症明显，只能通过实验室检测确诊，而血清学检测和病毒的分离鉴定等方法耗时长，受不确定因素影响，不能满足实际情况中准确快速的检疫要求，因此迫切需要开。Ｄ，Ｄ
以胳驼外周血淋巴细胞提取的总ＲＮＡ反转录合成的ｃＤＮＡ为模板，利用特异性??引物，通过两轮ＰＣＲ反应获得ＶＨＨ基因。第一轮ＰＣＲ获得抗体前导肽至ＣＨ２区基??因序列，大小在７００?ｂｐ左右，如图３?Ａ所示。第二轮ＰＣＲ获得ＶＨＨ基因ＦＲ１－ＦＲ４??全长基因，片段大小为４００?ｂｐ左右，如图３?Ｂ所示。??Ａ?Ｂ??（ｂｐ）?Ｍ?１?２?３?４?５?（ｂｐ）?Ｍ?１?２??１?歷三??图３?ＩＢＲＶ?ＶＨＨ基因ＰＣＲ扩增结果??Ｆｉｇ．?３?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ＩＢＲＶ?ＶＨＨ?ｇｅｎｅ??注：Ａ：?ｌａｎｅＭ：?ＤＬ２０００?Ｍａｒｋｅｒ，?ｌａｎｅ卜５：?ＶｌＩＩＩ?基因一轮扩增??Ｂ：?ｌａｎｅＭ：?ＤＬ２０００?Ｍａｒｋｅｒ，?ｌａｎｅ卜２：?ＶＨＨ?基因—轮扩增??３．?３．?２骆驼血清ＥＬＩＳＡ检测抗体效价结果??以ＩＢＲＶ包被９６孔板，将骆驼经４次免疫后采集血清，倍比稀释，并以基础血??清为阴性对照，进行ＥＬＩＳＡ血清抗体效价测定。结果如图４所示：骆驼血清抗ＩＢＲＶ??抗体效价达到ｈ?４０９６。??
【参考文献】：
期刊论文
[1]有关免疫球蛋白（IgD）的三问[J]. 董媛媛,李敏哲,周健. 农村科学实验. 2017(10)
[2]双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库的构建与鉴定[J]. 胡湘云,高小龙,付向晶,刘丹丹,范文涛,王燕平,杜恩岐,王兴龙,党如意,杨增岐. 畜牧兽医学报. 2015(06)
[3]牛免疫抑制性疾病的免疫抑制机理与发生原因[J]. 柳美玲,胡士林,王爱华. 中国动物保健. 2015(02)
[4]重链抗体的结构特点及其应用前景分析[J]. 蔡家麟,夏立亮,潘欣,王颖. 生命科学. 2013(09)
[5]抗体药物研发概况[J]. 沈倍奋. 河南大学学报(医学版). 2012(04)
[6]单域抗体研究进展[J]. 潘欣,潘伯驹,蔡家麟,李晗,王颖,蓝乐夫,廖万清. 生命科学. 2012(05)
[7]单克隆抗体研究进展[J]. 刘萍,陈苗苗,刘学荣,牟克斌,黄银君. 中国畜牧兽医. 2012(01)
[8]抗体库的起源、发展及应用前景[J]. 戴和平. 生物工程学报. 2011(05)
[9]驼源天然单域重链抗体库的构建与鉴定[J]. 涂追,许杨,刘夏,何庆华,陶勇. 中国生物工程杂志. 2011(04)
[10]噬菌体展示技术在感染性疾病诊断上的应用[J]. 刘敏,王露楠. 国际检验医学杂志. 2009(03)
博士论文
[1]牛副流感病毒3型HN基因—牛传染性鼻气管炎重组病毒的构建与鉴定[D]. 宋玲玲.石河子大学 2016
硕士论文
[1]BVDV与IBRV感染MDBK细胞的病毒复制与细胞凋亡研究[D]. 王华欣.黑龙江八一农垦大学 2017
[2]猪流行性腹泻病毒S蛋白的表达及其特异性单域抗体的制备[D]. 赵鑫鑫.内蒙古农业大学 2017
[3]双峰驼天然单域抗体库的构建及重链抗体特异性多抗的制备[D]. 芦婷.内蒙古农业大学 2016
[4]牛传染性鼻气管炎病毒gD基因的表达及ELISA诊断方法的建立[D]. 齐晓雪.黑龙江八一农垦大学 2015
[5]IBRV对牛单核巨噬细胞表达细胞因子的影响[D]. 陈玉惠.内蒙古农业大学 2013
[6]牛疱疹病毒I型gB基因的单克隆抗体制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立[D]. 李艳莉.扬州大学 2013
[7]IBRV XA株的分离鉴定及其gD蛋白的原核表达[D]. 李河林.西北农林科技大学 2010
[8]牛传染性鼻气管炎病毒抗体间接ELISA的建立及其在流行病学研究中的应用[D]. 颜邦芬.华中农业大学 2007
[9]IBRV gC和gD基因的原核表达与真核表达载体的构建[D]. 庄东明.山东农业大学 2006
本文编号：3068705
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１?ｇＤ基因ＰＣＲ扩增结果??
图２?ＩＢＲＶ?ｇＤ诱导表达结果??Ｆｉｇ?２?ＩＢＲＶ?ｇＤ?ｉｎｄｕｃｅｄ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ??注：Ａ：?ＬａｎｃＭ：?Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍａｒｋｅｒ，Ｌａｎｅｌ：末诱导的菌液，Ｌａｎｅ２：菌体破碎?ｈ清，Ｌａｎｃ３：菌沉淀，Ｌａｎｅ４：?ｇＤ蛋ｆｔ纯化流穿液，Ｌａｎｅ５－６：?ｇＤ蛋白纯化产物??Ｂ：?ＬａｎｅＭ：?Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ?ｐｒｏｔｏｉｎ?ｍａｒｋｅｒ，?Ｌａｎｅｌ：?ｇＤ?蛋ｆｔ?Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ?条带??２．?４讨论??ＩＢＲ给全球的养牛业带来巨大的经济损失，世界动物卫生组织曾将其列为Ｂ病，也是我国入境动物必检疫病之一。??虽然接种传统疫苗，可以产生的免疫效果，控制发病，抑制病毒的复制和传但是，ｆｆｉＲＶ并不能彻底的被机体免疫力清除，而是转为隐形感染。尽管如此，扑杀的成本太高，接种疫苗还是大部分国家防控的主要措施［５〇］。ＩＢＲＶ感染后症明显，只能通过实验室检测确诊，而血清学检测和病毒的分离鉴定等方法耗时长，受不确定因素影响，不能满足实际情况中准确快速的检疫要求，因此迫切需要开。Ｄ，Ｄ
以胳驼外周血淋巴细胞提取的总ＲＮＡ反转录合成的ｃＤＮＡ为模板，利用特异性??引物，通过两轮ＰＣＲ反应获得ＶＨＨ基因。第一轮ＰＣＲ获得抗体前导肽至ＣＨ２区基??因序列，大小在７００?ｂｐ左右，如图３?Ａ所示。第二轮ＰＣＲ获得ＶＨＨ基因ＦＲ１－ＦＲ４??全长基因，片段大小为４００?ｂｐ左右，如图３?Ｂ所示。??Ａ?Ｂ??（ｂｐ）?Ｍ?１?２?３?４?５?（ｂｐ）?Ｍ?１?２??１?歷三??图３?ＩＢＲＶ?ＶＨＨ基因ＰＣＲ扩增结果??Ｆｉｇ．?３?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ＩＢＲＶ?ＶＨＨ?ｇｅｎｅ??注：Ａ：?ｌａｎｅＭ：?ＤＬ２０００?Ｍａｒｋｅｒ，?ｌａｎｅ卜５：?ＶｌＩＩＩ?基因一轮扩增??Ｂ：?ｌａｎｅＭ：?ＤＬ２０００?Ｍａｒｋｅｒ，?ｌａｎｅ卜２：?ＶＨＨ?基因—轮扩增??３．?３．?２骆驼血清ＥＬＩＳＡ检测抗体效价结果??以ＩＢＲＶ包被９６孔板，将骆驼经４次免疫后采集血清，倍比稀释，并以基础血??清为阴性对照，进行ＥＬＩＳＡ血清抗体效价测定。结果如图４所示：骆驼血清抗ＩＢＲＶ??抗体效价达到ｈ?４０９６。??
【参考文献】：
期刊论文
[1]有关免疫球蛋白（IgD）的三问[J]. 董媛媛,李敏哲,周健. 农村科学实验. 2017(10)
[2]双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库的构建与鉴定[J]. 胡湘云,高小龙,付向晶,刘丹丹,范文涛,王燕平,杜恩岐,王兴龙,党如意,杨增岐. 畜牧兽医学报. 2015(06)
[3]牛免疫抑制性疾病的免疫抑制机理与发生原因[J]. 柳美玲,胡士林,王爱华. 中国动物保健. 2015(02)
[4]重链抗体的结构特点及其应用前景分析[J]. 蔡家麟,夏立亮,潘欣,王颖. 生命科学. 2013(09)
[5]抗体药物研发概况[J]. 沈倍奋. 河南大学学报(医学版). 2012(04)
[6]单域抗体研究进展[J]. 潘欣,潘伯驹,蔡家麟,李晗,王颖,蓝乐夫,廖万清. 生命科学. 2012(05)
[7]单克隆抗体研究进展[J]. 刘萍,陈苗苗,刘学荣,牟克斌,黄银君. 中国畜牧兽医. 2012(01)
[8]抗体库的起源、发展及应用前景[J]. 戴和平. 生物工程学报. 2011(05)
[9]驼源天然单域重链抗体库的构建与鉴定[J]. 涂追,许杨,刘夏,何庆华,陶勇. 中国生物工程杂志. 2011(04)
[10]噬菌体展示技术在感染性疾病诊断上的应用[J]. 刘敏,王露楠. 国际检验医学杂志. 2009(03)
博士论文
[1]牛副流感病毒3型HN基因—牛传染性鼻气管炎重组病毒的构建与鉴定[D]. 宋玲玲.石河子大学 2016
硕士论文
[1]BVDV与IBRV感染MDBK细胞的病毒复制与细胞凋亡研究[D]. 王华欣.黑龙江八一农垦大学 2017
[2]猪流行性腹泻病毒S蛋白的表达及其特异性单域抗体的制备[D]. 赵鑫鑫.内蒙古农业大学 2017
[3]双峰驼天然单域抗体库的构建及重链抗体特异性多抗的制备[D]. 芦婷.内蒙古农业大学 2016
[4]牛传染性鼻气管炎病毒gD基因的表达及ELISA诊断方法的建立[D]. 齐晓雪.黑龙江八一农垦大学 2015
[5]IBRV对牛单核巨噬细胞表达细胞因子的影响[D]. 陈玉惠.内蒙古农业大学 2013
[6]牛疱疹病毒I型gB基因的单克隆抗体制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立[D]. 李艳莉.扬州大学 2013
[7]IBRV XA株的分离鉴定及其gD蛋白的原核表达[D]. 李河林.西北农林科技大学 2010
[8]牛传染性鼻气管炎病毒抗体间接ELISA的建立及其在流行病学研究中的应用[D]. 颜邦芬.华中农业大学 2007
[9]IBRV gC和gD基因的原核表达与真核表达载体的构建[D]. 庄东明.山东农业大学 2006
本文编号：3068705
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