蒙古牛MSTN基因敲除的研究
发布时间：2021-03-07 08:24
肌肉生长抑制素基因（MSTN）的突变可导致动物肌肉的显著增长，这一发现提示可以通过抑制该基因的表达提高动物肌肉的产量。本研究旨在通过基因敲除的方式建立转基因体细胞系。首先，从蒙古牛肌肉组织中提取蒙古牛基因组DNA，根据基因序列设计引物，利用PCR技术扩增得到用于载体构建的同源序列。其次，构建基因打靶载体。同时，以组织块贴壁法原代培养获得蒙古牛胎儿皮肤成纤维细胞。将载体转染入细胞后经正筛选，共获得253个细胞克隆，将这些单克隆细胞提取基因组DNA进行PCR扩增鉴定得到2个阳性克隆。与普通成纤维细胞相比，所得敲除MSTN基因的阳性细胞克隆在细胞形态、性状及生长特性等方面均发生了极其显著的变化，表现为细胞体积增大；边界模糊，立体感降低；生长速率下降明显；胰蛋白酶消化所需时间明显增加。研究认为，细胞形态和生长特性的改变可能受到转染过程、经过药物筛选、长时间在体外培养的影响，也可能与MSTN基因的敲除有关。本研究为采用分子育种手段培养高产肉量蒙古牛奠定了一定的基础。
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：44 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
载体结构图
PCR 反应条件：94℃ 5min94℃ 30s50℃ 30s 25cycles72℃ 45s72℃ 10min4 ℃ ∞扩增产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，核酸染料染色，上样量为 5μL，100V电泳 30min。4 结果4.1 实验一 基因克隆以蒙古牛基因组 DNA 为模板，用引物 SF 和 SR 扩增同源短臂 S，用引物 LF和 LR 扩增同源长臂 L，PCR 鉴定见图 2。1 2 3 4 5 1 2 3 4
A B图 3 A：同源重组短臂和 T 载体连接后的 PCR 鉴定；B：同源重组长臂和 T 载体连接后的 PCR 鉴定Fig.3 PCR identification of homologous short arm（A）and homologous arm（B）注：图 A 泳道 1-5 为 T+S菌落 1-5 的 PCR 产物，大小约 1000bp，泳道 6 为 MakerDL5000;图 B 泳道 2-5 为T+L 菌落 1-4 的 PCR 产物，大小约 5000bp，泳道 1 为 M akerDL5000。4.2.2 同源重组片段与载体 pFPC-1 的连接用 XbaI 和 PmeI 酶切 T+S，用 ClaI 和 NotI 酶切 T+L 鉴定见图 4。
【参考文献】：
期刊论文
[1]山羊转人乳铁蛋白基因成纤维细胞和乳腺上皮细胞单克隆的制备及扩大培养[J]. 张玉玲,刘凤军,张涌. 安徽农业科学. 2009(31)
[2]转化生长因子β作用研究进展[J]. 陈蕾,邸大琳,崔为发. 医学理论与实践. 2006(04)
[3]肌肉生长抑制素基因的研究进展[J]. 王芳,赵春丽,郝艳红. 黑龙江畜牧兽医. 2003(04)
[4]基因打靶技术及其应用前景[J]. 李瑞国,安晓荣,苟克勉,陈永福. 生物技术通报. 2002(05)
[5]猪肌生成抑制素基因的克隆和序列测定[J]. 欧阳红生,孙燕,张永亮,李慎涛,张锐,廖晓萍,张玉静,赵建军,赵凤云. 中国兽医学报. 2001(05)
[6]血清因素对阳离子脂质体转染的影响及其对策[J]. 王瓞,林其谁. 细胞生物学杂志. 1998(03)
博士论文
[1]用绿色荧光蛋白和肝再生增强因子基因进行转基因绵羊胚胎的研究[D]. 马玉珍.内蒙古大学 2004
硕士论文
[1]绒山羊FGF5基因的序列分析及其敲除载体构建[D]. 苏少锋.内蒙古农业大学 2011
本文编号：3068719
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：44 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
载体结构图
PCR 反应条件：94℃ 5min94℃ 30s50℃ 30s 25cycles72℃ 45s72℃ 10min4 ℃ ∞扩增产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，核酸染料染色，上样量为 5μL，100V电泳 30min。4 结果4.1 实验一 基因克隆以蒙古牛基因组 DNA 为模板，用引物 SF 和 SR 扩增同源短臂 S，用引物 LF和 LR 扩增同源长臂 L，PCR 鉴定见图 2。1 2 3 4 5 1 2 3 4
A B图 3 A：同源重组短臂和 T 载体连接后的 PCR 鉴定；B：同源重组长臂和 T 载体连接后的 PCR 鉴定Fig.3 PCR identification of homologous short arm（A）and homologous arm（B）注：图 A 泳道 1-5 为 T+S菌落 1-5 的 PCR 产物，大小约 1000bp，泳道 6 为 MakerDL5000;图 B 泳道 2-5 为T+L 菌落 1-4 的 PCR 产物，大小约 5000bp，泳道 1 为 M akerDL5000。4.2.2 同源重组片段与载体 pFPC-1 的连接用 XbaI 和 PmeI 酶切 T+S，用 ClaI 和 NotI 酶切 T+L 鉴定见图 4。
【参考文献】：
期刊论文
[1]山羊转人乳铁蛋白基因成纤维细胞和乳腺上皮细胞单克隆的制备及扩大培养[J]. 张玉玲,刘凤军,张涌. 安徽农业科学. 2009(31)
[2]转化生长因子β作用研究进展[J]. 陈蕾,邸大琳,崔为发. 医学理论与实践. 2006(04)
[3]肌肉生长抑制素基因的研究进展[J]. 王芳,赵春丽,郝艳红. 黑龙江畜牧兽医. 2003(04)
[4]基因打靶技术及其应用前景[J]. 李瑞国,安晓荣,苟克勉,陈永福. 生物技术通报. 2002(05)
[5]猪肌生成抑制素基因的克隆和序列测定[J]. 欧阳红生,孙燕,张永亮,李慎涛,张锐,廖晓萍,张玉静,赵建军,赵凤云. 中国兽医学报. 2001(05)
[6]血清因素对阳离子脂质体转染的影响及其对策[J]. 王瓞,林其谁. 细胞生物学杂志. 1998(03)
博士论文
[1]用绿色荧光蛋白和肝再生增强因子基因进行转基因绵羊胚胎的研究[D]. 马玉珍.内蒙古大学 2004
硕士论文
[1]绒山羊FGF5基因的序列分析及其敲除载体构建[D]. 苏少锋.内蒙古农业大学 2011
本文编号：3068719
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