新城疫病毒通过激活真核翻译起始因子4F促进病毒增殖
发布时间：2021-03-09 04:03
新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是一种与养禽业经济息息相关的重要禽类病毒，由其引起的新城疫（Newcastle disease，ND）具有高度的传染性和致死性，严重威胁了世界养禽业的正常发展。新城疫病毒属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、禽腮腺炎病毒属（Avulavirus），基因组为不分节段的单股负链RNA，其基因组按照3′-Leader-NP-P-M-F-HN-L-Trailer5′的顺序编码6种结构蛋白。NDV病毒蛋白的翻译依赖于宿主的翻译系统，其mRNA与大多数真核生物一样都具有5＇帽子结构，一般认为L蛋白具有加帽酶的活性能够在病毒mRNA的5＇端形成缺少2’-O甲基化的“cap0”型帽子结构。新城疫病毒在细胞内具有很强的增殖能力，感染后能够迅速、大量地合成病毒自身RNA和蛋白，完成装配。新城疫病毒RNA的合成是依赖其自身合成的病毒RNA聚合酶，启动病毒的转录机制，但是转录后的翻译机制尚未可知。大多数真核生物的mRNA都具有3’ poly A尾和5’甲基化的帽子结构，并利用帽子结构依赖性的真核翻译系统进行mRNA的翻译。翻译的起...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：112 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
图表目录
英文缩略表
第一章 引言
1.1 新城疫病毒概述
1.2 真核翻译起始研究进展
1.2.1 真核翻译起始概述
1.2.2 真核生物帽子结构的分类
1.2.3 翻译起始复合体 eIF4F
1.2.4 翻译起始复合体 eIF4F 功能的调控机制
1.2.4.1 PI3K/Akt/mTOR 通路对 eIF4F 功能的调控
1.2.4.2 促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路对 eIF4E 磷酸化水平的调节
1.3 病毒“劫持”真核翻译系统的研究进展
1.3.1 抑制宿主 mRNA 的翻译
1.3.1.1 病毒对真核翻译起始因子的直接调节作用
1.3.1.2 病毒对真核翻译起始因子的间接调节作用
1.3.1.3 病毒通过对 RNA 的调节来控制蛋白质翻译
1.3.2 帽子结构非依赖性（cap-independent）翻译机制
1.3.2.1 在 mRNA 的 5’端偶联病毒蛋白
1.3.2.2 IRES-依赖性的翻译机制
1.3.3 病毒对宿主帽子结构依赖性（cap-dependent）蛋白翻译的调节作用
1.3.3.1 DNA 病毒对帽子结构依赖性（cap-dependent）蛋白翻译的调控
1.3.3.2 RNA 病毒对帽子结构依赖性（cap-dependent）蛋白翻译的调控
1.3.4 eIF2α在调控蛋白翻译和抗病毒免疫方面的作用
1.3.4.1 病毒对 eIF2α磷酸化的抑制作用
1.3.4.2 病毒采用不依赖于 eIF2 的翻译机制逃避 eIF2α磷酸化所产生的抑制作用
1.3.5 病毒调控宿主翻译系统研究展望
1.4 本研究的目的及意义
第二章 新城疫病毒 NP 蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备
摘要
2.1 材料和方法
2.1.1 病毒
2.1.2 细胞和实验动物使用
2.1.3 原核表达载体和主要试剂
2.1.4 主要缓冲液及试剂的配制
2.1.5 DUCK/JS/10 弱毒株 NP 蛋白的克隆与原核表达
2.1.6 重组 NP 蛋白的原核表达及纯化
2.1.7 动物免疫及间接 ELISA 检测方法的建立
2.1.8 单克隆抗体的制备
2.1.9 单克隆抗体效价的检测
2.1.9.1 间接 ELISA 检测
2.1.9.2 间接免疫荧光鉴定
2.1.9.3 Western Blot 检测
2.1.10 NP 单克隆抗体与不同毒株反应性检测
2.2 结果
2.2.1 NP 基因扩增及重组表达载体的构建及鉴定
2.2.2 pET-32a-NP 重组蛋白的诱导表达及纯化
2.2.3 阳性杂交瘤细胞株的建立及腹水抗体效价测定
2.2.4 NP 单克隆抗体的间接免疫荧光（IFA）检测
2.2.5 NP 单克隆抗体的 Western Blot 检测
2.2.6 NP 单克隆抗体与不同 NDV 毒株反应性检测
2.3 讨论
第三章 新城疫病毒依赖宿主真核翻译系统进行病毒蛋白合成
摘要
3.1 材料和方法
3.1.1 病毒和细胞系
3.1.2 抗体及主要试剂
3.1.3 主要缓冲液及试剂配制
3.1.4 Western-blot 检测 NDV 感染后 eIF4F 各组分的磷酸化水平变化
3.1.5 紫外灭活新城疫病毒诱导 eIF4F 磷酸化检测
3.1.6 m7GTP pull down 检测 NDV 感染后 eIF4F 复合体的装配活性变化
3.1.7 间接免疫荧光（IFA）观察 NP 蛋白与 eIF4E 共定位
3.1.8 eIF4E 和/或 eIF4G 的干扰对 NDV 复制的影响
3.2 结果
3.2.1 新城疫病毒感染后诱导 eIF4E 和 eIF4G 的磷酸化
3.2.2 紫外灭活的新城疫病毒不诱导 eIF4E 和 eIF4G 的磷酸化
3.2.3 新城疫病毒感染能够诱导 eIF4F 复合体的装配
3.2.4 新城疫病毒感染能够诱导 eIF4E 发生亚细胞定位变化
3.2.5 eIF4E 和/或 eIF4G 的缺失能够影响新城疫病毒蛋白的合成
3.3 讨论
第四章 PI3K/AKT 通路在 NDV 激活 EIF4F 过程中的调控作用
摘要
4.1 材料和方法
4.1.1 病毒和细胞系
4.1.2 抗体及主要试剂
4.1.3 主要缓冲液及试剂配制
4.1.4 NDV 感染后 PI3K/Akt 通路及下游信号分子的磷酸化检测
4.1.5 超氧化物歧化酶（WST-1）法筛选最适抑制剂工作浓度
4.1.6 抑制剂阻断 PI3K/Akt/mTOR 通路后下游信号分子磷酸化水平检测
4.1.7 抑制剂阻断 PI3K/Akt/mTOR 通路后对 eIF4F 复合体装配的影响
4.2 结果
4.2.1 新城疫感染诱导 PI3K/Akt 通路及下游信号分子的活化
4.2.2 新城疫感染可诱导 4E-BP1 发生过磷酸化
4.2.3 最适抑制剂工作浓度的确定
4.2.4 PI3K 参与介导 NDV 感染所诱导的 Akt 及下游信号分子的磷酸化
4.2.5 mTOR 激酶介导 NDV 感染所引起的 eIF4G 磷酸化
4.2.6 NDV 诱导的 4E-BP1 过磷酸化能够拮抗 Rapamycin 的抑制作用
4.2.7 NDV 感染后通过激活 PI3K/Akt 通路诱导 eIF4F 复合体的形成
4.2.8 LY294002 对新城疫病毒复制的影响
4.2.9 Rapamycin 不抑制 NDV 感染所诱导的 eIF4F 复合体的形成
4.2.10 Rapamycin 对新城疫病毒复制的影响
4.3 讨论
第五章 MAPK 信号通路在 NDV 激活 EIF4F 过程中的调控作用
摘要
5.1 材料和方法
5.1.1 病毒和细胞系
5.1.2 抗体及主要试剂
5.1.3 主要缓冲液及试剂配制
5.1.4 NDV 感染后 p38、Erk1/2 及下游 Mnk1 激酶的磷酸化检测
5.1.5 超氧化物歧化酶（WST-1）法筛选最适抑制剂工作浓度
5.1.6 抑制剂阻断 p38、Erk1/2 及下游 Mnk1 后下游信号分子磷酸化检测
5.1.7 抑制剂阻断 p38MAPK/Mnk1 通路后对 eIF4F 复合体装配的影响
5.2 结果
5.2.1 新城疫感染诱导 p38、Erk1/2 及下游 Mnk1 的活化
5.2.2 最适抑制剂工作浓度的确定
5.2.3 NDV 感染通过激活 Mnk1 诱导 eIF4E 发生磷酸化
5.2.4 Erk1/2 不介导新城疫病毒感染所引起的 eIF4E 的磷酸化
5.2.5 p38MAPK 介导 NDV 感染诱导的 Mnk1 以及下游 eIF4E 的磷酸化
5.2.6 NDV 感染不通过激活 Mnk1 激酶诱导 4E-BP1 的过磷酸化
5.2.7 NDV 感染不通过激活 MAPK 信号通路诱导 4E-BP1 的过磷酸化
5.2.8 MAPK 通路不介导 NDV 诱导的 eIF4F 复合体形成
5.2.9 MAPK 通路对新城疫病毒复制的影响
5.3 讨论
第六章 新城疫病毒 NP 蛋白与 EIF4F 复合体相互作用
摘要
6.1 材料和方法
6.1.1 病毒和细胞系
6.1.2 抗体和质粒
6.1.3 主要试剂
6.1.4 主要缓冲液及试剂配制
6.1.5 NP 相关真核表达质粒的构建
6.1.6 FLAG-NP 及各突变体的表达及 Western-Blot 检测
6.1.7 m7GTP pull down 检测病毒蛋白与 eIF4F 复合体的互作
6.1.8 新城疫 NP 蛋白与 eIF4F 复合体的免疫共沉淀（Co-IP）
6.2 结果
6.2.1 m7GTP pull down 显示 NP 蛋白可能与 eIF4F 复合体存在相互作用
6.2.2 NDV 感染后 NP 蛋白与 eIF4F 复合体的免疫共沉淀
6.2.3 NP 蛋白与 eIF4F 复合体的相互作用不需要其他病毒蛋白辅助
6.2.4 FLAG-NP mutant 真核表达质粒的构建
6.2.5 FLAG-NP 各突变体的真核表达及 Western-Blot 检测
6.2.6 新城疫病毒 NP 蛋白与 eIF4F 复合体互作结构域分析
6.3 讨论
第七章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3072213
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：112 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
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图表目录
英文缩略表
第一章 引言
1.1 新城疫病毒概述
1.2 真核翻译起始研究进展
1.2.1 真核翻译起始概述
1.2.2 真核生物帽子结构的分类
1.2.3 翻译起始复合体 eIF4F
1.2.4 翻译起始复合体 eIF4F 功能的调控机制
1.2.4.1 PI3K/Akt/mTOR 通路对 eIF4F 功能的调控
1.2.4.2 促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路对 eIF4E 磷酸化水平的调节
1.3 病毒“劫持”真核翻译系统的研究进展
1.3.1 抑制宿主 mRNA 的翻译
1.3.1.1 病毒对真核翻译起始因子的直接调节作用
1.3.1.2 病毒对真核翻译起始因子的间接调节作用
1.3.1.3 病毒通过对 RNA 的调节来控制蛋白质翻译
1.3.2 帽子结构非依赖性（cap-independent）翻译机制
1.3.2.1 在 mRNA 的 5’端偶联病毒蛋白
1.3.2.2 IRES-依赖性的翻译机制
1.3.3 病毒对宿主帽子结构依赖性（cap-dependent）蛋白翻译的调节作用
1.3.3.1 DNA 病毒对帽子结构依赖性（cap-dependent）蛋白翻译的调控
1.3.3.2 RNA 病毒对帽子结构依赖性（cap-dependent）蛋白翻译的调控
1.3.4 eIF2α在调控蛋白翻译和抗病毒免疫方面的作用
1.3.4.1 病毒对 eIF2α磷酸化的抑制作用
1.3.4.2 病毒采用不依赖于 eIF2 的翻译机制逃避 eIF2α磷酸化所产生的抑制作用
1.3.5 病毒调控宿主翻译系统研究展望
1.4 本研究的目的及意义
第二章 新城疫病毒 NP 蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备
摘要
2.1 材料和方法
2.1.1 病毒
2.1.2 细胞和实验动物使用
2.1.3 原核表达载体和主要试剂
2.1.4 主要缓冲液及试剂的配制
2.1.5 DUCK/JS/10 弱毒株 NP 蛋白的克隆与原核表达
2.1.6 重组 NP 蛋白的原核表达及纯化
2.1.7 动物免疫及间接 ELISA 检测方法的建立
2.1.8 单克隆抗体的制备
2.1.9 单克隆抗体效价的检测
2.1.9.1 间接 ELISA 检测
2.1.9.2 间接免疫荧光鉴定
2.1.9.3 Western Blot 检测
2.1.10 NP 单克隆抗体与不同毒株反应性检测
2.2 结果
2.2.1 NP 基因扩增及重组表达载体的构建及鉴定
2.2.2 pET-32a-NP 重组蛋白的诱导表达及纯化
2.2.3 阳性杂交瘤细胞株的建立及腹水抗体效价测定
2.2.4 NP 单克隆抗体的间接免疫荧光（IFA）检测
2.2.5 NP 单克隆抗体的 Western Blot 检测
2.2.6 NP 单克隆抗体与不同 NDV 毒株反应性检测
2.3 讨论
第三章 新城疫病毒依赖宿主真核翻译系统进行病毒蛋白合成
摘要
3.1 材料和方法
3.1.1 病毒和细胞系
3.1.2 抗体及主要试剂
3.1.3 主要缓冲液及试剂配制
3.1.4 Western-blot 检测 NDV 感染后 eIF4F 各组分的磷酸化水平变化
3.1.5 紫外灭活新城疫病毒诱导 eIF4F 磷酸化检测
3.1.6 m7GTP pull down 检测 NDV 感染后 eIF4F 复合体的装配活性变化
3.1.7 间接免疫荧光（IFA）观察 NP 蛋白与 eIF4E 共定位
3.1.8 eIF4E 和/或 eIF4G 的干扰对 NDV 复制的影响
3.2 结果
3.2.1 新城疫病毒感染后诱导 eIF4E 和 eIF4G 的磷酸化
3.2.2 紫外灭活的新城疫病毒不诱导 eIF4E 和 eIF4G 的磷酸化
3.2.3 新城疫病毒感染能够诱导 eIF4F 复合体的装配
3.2.4 新城疫病毒感染能够诱导 eIF4E 发生亚细胞定位变化
3.2.5 eIF4E 和/或 eIF4G 的缺失能够影响新城疫病毒蛋白的合成
3.3 讨论
第四章 PI3K/AKT 通路在 NDV 激活 EIF4F 过程中的调控作用
摘要
4.1 材料和方法
4.1.1 病毒和细胞系
4.1.2 抗体及主要试剂
4.1.3 主要缓冲液及试剂配制
4.1.4 NDV 感染后 PI3K/Akt 通路及下游信号分子的磷酸化检测
4.1.5 超氧化物歧化酶（WST-1）法筛选最适抑制剂工作浓度
4.1.6 抑制剂阻断 PI3K/Akt/mTOR 通路后下游信号分子磷酸化水平检测
4.1.7 抑制剂阻断 PI3K/Akt/mTOR 通路后对 eIF4F 复合体装配的影响
4.2 结果
4.2.1 新城疫感染诱导 PI3K/Akt 通路及下游信号分子的活化
4.2.2 新城疫感染可诱导 4E-BP1 发生过磷酸化
4.2.3 最适抑制剂工作浓度的确定
4.2.4 PI3K 参与介导 NDV 感染所诱导的 Akt 及下游信号分子的磷酸化
4.2.5 mTOR 激酶介导 NDV 感染所引起的 eIF4G 磷酸化
4.2.6 NDV 诱导的 4E-BP1 过磷酸化能够拮抗 Rapamycin 的抑制作用
4.2.7 NDV 感染后通过激活 PI3K/Akt 通路诱导 eIF4F 复合体的形成
4.2.8 LY294002 对新城疫病毒复制的影响
4.2.9 Rapamycin 不抑制 NDV 感染所诱导的 eIF4F 复合体的形成
4.2.10 Rapamycin 对新城疫病毒复制的影响
4.3 讨论
第五章 MAPK 信号通路在 NDV 激活 EIF4F 过程中的调控作用
摘要
5.1 材料和方法
5.1.1 病毒和细胞系
5.1.2 抗体及主要试剂
5.1.3 主要缓冲液及试剂配制
5.1.4 NDV 感染后 p38、Erk1/2 及下游 Mnk1 激酶的磷酸化检测
5.1.5 超氧化物歧化酶（WST-1）法筛选最适抑制剂工作浓度
5.1.6 抑制剂阻断 p38、Erk1/2 及下游 Mnk1 后下游信号分子磷酸化检测
5.1.7 抑制剂阻断 p38MAPK/Mnk1 通路后对 eIF4F 复合体装配的影响
5.2 结果
5.2.1 新城疫感染诱导 p38、Erk1/2 及下游 Mnk1 的活化
5.2.2 最适抑制剂工作浓度的确定
5.2.3 NDV 感染通过激活 Mnk1 诱导 eIF4E 发生磷酸化
5.2.4 Erk1/2 不介导新城疫病毒感染所引起的 eIF4E 的磷酸化
5.2.5 p38MAPK 介导 NDV 感染诱导的 Mnk1 以及下游 eIF4E 的磷酸化
5.2.6 NDV 感染不通过激活 Mnk1 激酶诱导 4E-BP1 的过磷酸化
5.2.7 NDV 感染不通过激活 MAPK 信号通路诱导 4E-BP1 的过磷酸化
5.2.8 MAPK 通路不介导 NDV 诱导的 eIF4F 复合体形成
5.2.9 MAPK 通路对新城疫病毒复制的影响
5.3 讨论
第六章 新城疫病毒 NP 蛋白与 EIF4F 复合体相互作用
摘要
6.1 材料和方法
6.1.1 病毒和细胞系
6.1.2 抗体和质粒
6.1.3 主要试剂
6.1.4 主要缓冲液及试剂配制
6.1.5 NP 相关真核表达质粒的构建
6.1.6 FLAG-NP 及各突变体的表达及 Western-Blot 检测
6.1.7 m7GTP pull down 检测病毒蛋白与 eIF4F 复合体的互作
6.1.8 新城疫 NP 蛋白与 eIF4F 复合体的免疫共沉淀（Co-IP）
6.2 结果
6.2.1 m7GTP pull down 显示 NP 蛋白可能与 eIF4F 复合体存在相互作用
6.2.2 NDV 感染后 NP 蛋白与 eIF4F 复合体的免疫共沉淀
6.2.3 NP 蛋白与 eIF4F 复合体的相互作用不需要其他病毒蛋白辅助
6.2.4 FLAG-NP mutant 真核表达质粒的构建
6.2.5 FLAG-NP 各突变体的真核表达及 Western-Blot 检测
6.2.6 新城疫病毒 NP 蛋白与 eIF4F 复合体互作结构域分析
6.3 讨论
第七章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3072213
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