CRISPR/Cas9高效等位基因编辑系统的构建及其在猪基因组编辑中的应用研究
发布时间：2021-03-09 03:59
基因组编辑是借助于细胞自身的DNA损伤修复机制对目标基因序列进行碱基删除、插入或突变的基因组操作过程。早期仅依靠自发性同源重组的基因组编辑效率极低,直到人工核酸酶出现,由人工核酸酶定点切割DNA产生双链断裂,激活体内DNA修复机制进行定点的基因组编辑,极大的提高了编辑的效率。随着测序技术的不断发展,一些基因得到注释,基因功能的研究成为重点和热点,目前研究基因功能的手段主要是基因修饰技术。近年来,CRISPR/Cas9核酸酶以其简单、快捷、高效的特点迅速发展,广泛运用于不同种类细胞的基因组修饰。精准的定点基因组编辑技术不仅能推进基因功能的研究,用于构建人类疾病模型、基因治疗,还能加快动物的遗传改良。双等位基因基因组修饰细胞的获得费时、费力且效率很低,目前这仍然是基因组编辑技术中的一个难点。本研究开发了一套CRISPR/Cas9高效等位基因编辑系统。该系统有效整合了基因编辑阳性细胞富集报告系统（Surrogate Reporter,Rep）与含有sgRNA的供体系统（Donor,Don）。其特点是既能作为供体提供修复的模板,又能作为报告系统反应核酸酶的活性和靶位点整合的效率。首先在哺乳动物...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：131 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
DNA双链断裂修复机制(Chugunovaetal.,2016)
锌指核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFN)是一种由锌指模块和FokI核酸酶结构域组成的嵌合蛋白(Kim et al., 1996)。单独的核酸酶结构域缺乏DNA识别特异性，只能依靠融合的锌指蛋白来特异识别DNA序列（图1-2）。锌指是普遍存在于转录因子中小的天然的DNA结构域，一个锌指可以识别三个碱基，锌指的这种相应的DNA识别简单规则和可使用几个连续的蛋白结构域识别连续的DNA序列允许研究者组装出基于锌指的人工DNA结合模块。由可设计的DNA结合位点和忠诚的核酸酶酶切部分组成了第一代可以直接用于基因组编辑的工具(Chugunova et al., 2016)。ⅡS型限制性内切酶，比如来源于海床黄杆菌的FokI，能识别短的DNA序列且在识别位点的一定间距切割DNA引起双链断裂。这种特性是因为这些蛋白的DNA结合位点和核酸酶结构域是分开的能独立行使功能的(Li et al., 1992)。核酸酶结构域没有明显的序列特异性，DNA断裂的位点可以通过改变DNA结合域的特异性而改变(Kim and Chandrasegaran, 1994)。Cys2-His2家族是最适合用于组合定点核酸酶的锌指，每一个锌指是很小的，大约有30个氨基酸，其二级结构是包含了一个α螺旋和两个β折叠的αββ结构。锌指核酸内切酶的一个特点是FokI需要形成二聚体才具有切割DNA双链的酶活性(Smith et al., 2000)，因此必需把两个锌指蛋白分别与FokI相结合
2013; Forsyth et al., 2016; Lee et al., 2015; T. Li et al., 2016; Nakade et al., 201o et al., 2015; Sun et al., 2012; Watanabe et al., 2014; Zu et al., 2013)。虽然TALE蛋蛋白大小类似，但却从识别三个碱基变成了识别一个碱基，这就使最终构建成更大，转染进入细胞的难度也是一个问题。和其它核酸酶一样，TALEN可以在似靶序列的地方造成脱靶的情况，不过可以通过选择不同于基因组上其它位点点（至少需要7个核苷酸）来解决这个问题。相对于ZFN，TALEN的构建更容易，TALEN只要简单的分子克隆技术就能完不需要耗费大量的时间。在靶位点识别上TALEN的选择范围更广泛，识别特异的能力更强，特异性更好，靶效率较高。但是，TALEN技术与ZFN一样，识别的都是蛋白质，一个TAL模块34个氨基酸才能识别一个碱基，所以构建一个识A特异序列的TALEN蛋白，有可能需要构建一个成百上千氨基酸的TALEN蛋白装上耗时外，还有可能引起细胞体内的免疫反应而降低编辑效率。在TALEN开代ZFNs人工核酸酶而引领一个新时代得到广泛的运用前，基于RNA介导的核CRISPR/Cas系统出现了，这项新技术直接取代TALEN成为基因组编辑新时代
本文编号：3072209
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：131 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
DNA双链断裂修复机制(Chugunovaetal.,2016)
锌指核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFN)是一种由锌指模块和FokI核酸酶结构域组成的嵌合蛋白(Kim et al., 1996)。单独的核酸酶结构域缺乏DNA识别特异性，只能依靠融合的锌指蛋白来特异识别DNA序列（图1-2）。锌指是普遍存在于转录因子中小的天然的DNA结构域，一个锌指可以识别三个碱基，锌指的这种相应的DNA识别简单规则和可使用几个连续的蛋白结构域识别连续的DNA序列允许研究者组装出基于锌指的人工DNA结合模块。由可设计的DNA结合位点和忠诚的核酸酶酶切部分组成了第一代可以直接用于基因组编辑的工具(Chugunova et al., 2016)。ⅡS型限制性内切酶，比如来源于海床黄杆菌的FokI，能识别短的DNA序列且在识别位点的一定间距切割DNA引起双链断裂。这种特性是因为这些蛋白的DNA结合位点和核酸酶结构域是分开的能独立行使功能的(Li et al., 1992)。核酸酶结构域没有明显的序列特异性，DNA断裂的位点可以通过改变DNA结合域的特异性而改变(Kim and Chandrasegaran, 1994)。Cys2-His2家族是最适合用于组合定点核酸酶的锌指，每一个锌指是很小的，大约有30个氨基酸，其二级结构是包含了一个α螺旋和两个β折叠的αββ结构。锌指核酸内切酶的一个特点是FokI需要形成二聚体才具有切割DNA双链的酶活性(Smith et al., 2000)，因此必需把两个锌指蛋白分别与FokI相结合
2013; Forsyth et al., 2016; Lee et al., 2015; T. Li et al., 2016; Nakade et al., 201o et al., 2015; Sun et al., 2012; Watanabe et al., 2014; Zu et al., 2013)。虽然TALE蛋蛋白大小类似，但却从识别三个碱基变成了识别一个碱基，这就使最终构建成更大，转染进入细胞的难度也是一个问题。和其它核酸酶一样，TALEN可以在似靶序列的地方造成脱靶的情况，不过可以通过选择不同于基因组上其它位点点（至少需要7个核苷酸）来解决这个问题。相对于ZFN，TALEN的构建更容易，TALEN只要简单的分子克隆技术就能完不需要耗费大量的时间。在靶位点识别上TALEN的选择范围更广泛，识别特异的能力更强，特异性更好，靶效率较高。但是，TALEN技术与ZFN一样，识别的都是蛋白质，一个TAL模块34个氨基酸才能识别一个碱基，所以构建一个识A特异序列的TALEN蛋白，有可能需要构建一个成百上千氨基酸的TALEN蛋白装上耗时外，还有可能引起细胞体内的免疫反应而降低编辑效率。在TALEN开代ZFNs人工核酸酶而引领一个新时代得到广泛的运用前，基于RNA介导的核CRISPR/Cas系统出现了，这项新技术直接取代TALEN成为基因组编辑新时代
本文编号：3072209
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