新孢子虫AMA1与RON2蛋白互作的鉴定及其免疫保护性研究
发布时间：2021-03-09 03:34
犬新孢子虫（Neospora caninum,N.caninum）是一种胞内寄生性原虫,属于顶复门原虫。新孢子虫病呈全球性分布,给养牛业造成巨大的经济损失,世界范围内针对新孢子虫病尚无特效药物或疫苗。新孢子虫入侵宿主细胞是虫体突破机体防线的关键节点,其入侵过程主要为识别并黏附宿主细胞形成滑动连接体MJ侵入细胞后定殖。入侵过程取决于多种蛋白质在寄生虫和宿主细胞之间的相互作用,因此,研究新孢子虫入侵机理有助于发现与入侵相关的基因和宿主靶标。近年来的研究表明弓形虫RON2/4/5/8与顶膜抗原-1（AMA1）组成的复合体是MJ的关键结构,新孢子虫顶膜抗原-1可与多种蛋白相互作用,但同RON2之间是否存在相互作用还尚未得到证实。因此本研究拟利用GST-Pull down和双分子荧光互补技术确定新孢子虫AMA1与RON2之间是否存在相互作用,利用免疫荧光技术（IFA）对新孢子虫AMA1与RON2进行亚细胞定位,并进行新孢子虫AMA1与RON2蛋白对小鼠和山羊的免疫保护性研究,为新型抗新孢子虫药物及疫苗靶标的开发提供参考。Nc AMA1与Nc RON2互作的GST-Pull down鉴定:GST-...
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重组质粒双酶切鉴定电泳图
第二篇研究内容第一章新孢子虫NcAMA1与NcRON2相互作用的鉴定25图1.2含His标签的pET-28a-NcAMA1载体蛋白表达与纯化电泳图（A）蛋白表达产物；（B）蛋白纯化产物；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：菌体超声上清液；2：纯化的pET-28a-NcAMA1载体蛋白Fig1.2ExpressionandpurificationelectrophoresisofpET-28a-NcAMA1vectorproteinwithHistag（A）Proteinexpressionproduct；（B）Proteinpurificationproducts；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：Supernatantoftheexpressionproduct；2：PurifiedpET-28a-NcAMA1carrierprotein2.1.3含GST标签的pGEX-4T-NcRON2载体蛋白表达及纯化将上述已经成功构建好并且已经成功转入BL21(DE3)感受态中的含GST标签的pGEX-4T-NcRON2载体用IPTG进行诱导表达，将表达后得到的菌液进行离心超声仪超声的得到的上清作为样品，然后经过蛋白电泳后发现蛋白表达的大小约为33kDa，且表达的蛋白为可溶性蛋白（图1.3A）；将蛋白进行纯化，再次进行蛋白电泳可发现得到一个具有单一条带的目的蛋白大小为33kDa且未发现有明显的杂带（图1.3B），说明含GST标签的pGEX-4T-NcRON2载体蛋白纯化效果较好，进行后续步骤。
第二篇研究内容第一章新孢子虫NcAMA1与NcRON2相互作用的鉴定26图1.3含GST标签的pGEX-4T-NcRON2载体蛋白表达与纯化电泳图（A）蛋白表达产物；（B）蛋白纯化产物；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：菌体超声上清液；2：纯化的pGEX-4T-NcRON2载体蛋白Fig1.3ExpressionandpurificationelectrophoresisofpGEX-4T-NcRON2vectorproteinwithHistag（B）Proteinexpressionproduct；（B）Proteinpurificationproducts；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：Supernatantoftheexpressionproduct；2：PurifiedpGEX-4T-NcRON2carrierprotein2.1.4GST-Pulldown试验将纯化后含GST标签的pGEX-4T-NcRON2载体蛋白和GST标签蛋白分别加入到GST蛋白纯化填料中，使其孵育后结合，之后将含His标签的pET-28a-NcAMA1载体蛋白分别等量加入到前面处理后的GST蛋白纯化填料中，完成GST-Pulldown试验。完成试验后使用WB试验对得到的洗脱液进行分析。结果：pGEX-4T-NcRON2载体蛋白与pET-28a-NcAMA1载体蛋白共孵育得到的洗脱液中可以发现存在pET-28a-NcAMA1载体蛋白含His标签的条带，GST标签蛋白与pET-28a-NcAMA1载体蛋白共孵育得到的洗脱液中没有发现存在pET-28a-NcAMA1载体蛋白含His标签的条带（图1.4），证明了新孢子虫NcAMA1
本文编号：3072175
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
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【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重组质粒双酶切鉴定电泳图
第二篇研究内容第一章新孢子虫NcAMA1与NcRON2相互作用的鉴定25图1.2含His标签的pET-28a-NcAMA1载体蛋白表达与纯化电泳图（A）蛋白表达产物；（B）蛋白纯化产物；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：菌体超声上清液；2：纯化的pET-28a-NcAMA1载体蛋白Fig1.2ExpressionandpurificationelectrophoresisofpET-28a-NcAMA1vectorproteinwithHistag（A）Proteinexpressionproduct；（B）Proteinpurificationproducts；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：Supernatantoftheexpressionproduct；2：PurifiedpET-28a-NcAMA1carrierprotein2.1.3含GST标签的pGEX-4T-NcRON2载体蛋白表达及纯化将上述已经成功构建好并且已经成功转入BL21(DE3)感受态中的含GST标签的pGEX-4T-NcRON2载体用IPTG进行诱导表达，将表达后得到的菌液进行离心超声仪超声的得到的上清作为样品，然后经过蛋白电泳后发现蛋白表达的大小约为33kDa，且表达的蛋白为可溶性蛋白（图1.3A）；将蛋白进行纯化，再次进行蛋白电泳可发现得到一个具有单一条带的目的蛋白大小为33kDa且未发现有明显的杂带（图1.3B），说明含GST标签的pGEX-4T-NcRON2载体蛋白纯化效果较好，进行后续步骤。
第二篇研究内容第一章新孢子虫NcAMA1与NcRON2相互作用的鉴定26图1.3含GST标签的pGEX-4T-NcRON2载体蛋白表达与纯化电泳图（A）蛋白表达产物；（B）蛋白纯化产物；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：菌体超声上清液；2：纯化的pGEX-4T-NcRON2载体蛋白Fig1.3ExpressionandpurificationelectrophoresisofpGEX-4T-NcRON2vectorproteinwithHistag（B）Proteinexpressionproduct；（B）Proteinpurificationproducts；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：Supernatantoftheexpressionproduct；2：PurifiedpGEX-4T-NcRON2carrierprotein2.1.4GST-Pulldown试验将纯化后含GST标签的pGEX-4T-NcRON2载体蛋白和GST标签蛋白分别加入到GST蛋白纯化填料中，使其孵育后结合，之后将含His标签的pET-28a-NcAMA1载体蛋白分别等量加入到前面处理后的GST蛋白纯化填料中，完成GST-Pulldown试验。完成试验后使用WB试验对得到的洗脱液进行分析。结果：pGEX-4T-NcRON2载体蛋白与pET-28a-NcAMA1载体蛋白共孵育得到的洗脱液中可以发现存在pET-28a-NcAMA1载体蛋白含His标签的条带，GST标签蛋白与pET-28a-NcAMA1载体蛋白共孵育得到的洗脱液中没有发现存在pET-28a-NcAMA1载体蛋白含His标签的条带（图1.4），证明了新孢子虫NcAMA1
本文编号：3072175
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