维氏气单胞菌rpoN基因缺失株的构建及部分生物学特性分析
发布时间：2021-03-10 05:57
为了研究rpoN基因对维氏气单胞菌致病性的影响,采用同源重组的方法构建该基因缺失株。以该菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增rpoN基因的上、下游同源臂;以上、下游同源臂胶回收产物为模板,P1-1/P2-2为引物进行重叠PCR扩增相应目的片段,从而获得rpoN上下游同源臂连接片段;将获取的连接片段连接pRE112,将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取重组质粒pRE112-rpoN,经同源重组和抗生素筛选获得维氏气单胞菌rpoN基因缺失株ΔrpoN。同时,依然利用重叠PCR将目的基因片段与启动子相连接,而后与质粒p BBR-MCS相连接,最后将重组质粒pBBR-MCS-rpoN转化至缺失株ΔrpoN中,构建互补株C-rpoN。PCR鉴定和测序结果显示,成功构建出维氏气单胞菌rpoN基因缺失株ΔrpoN和互补株C-rpoN。生物学特性分析试验结果表明rpoN的缺失导致维氏气单胞菌TH0426菌落形态改变、生物被膜形成能力下降、动物致病性减弱,鞭毛断裂,运动性丧失。本研究中成功构建了维氏气单胞菌TH0426株rpoN基因的缺失株ΔrpoN,为进一步研究维氏气单胞菌减毒疫苗和rpo...
【文章来源】：中国兽医科学. 2020,50(06)北大核心
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
rpoN基因缺失株的筛选与鉴定Figure1ScreeningandidentificationofrpoNgenedeletionstrainAB250bp100bp100bp
中国兽医科学第50卷图5维氏气单胞菌TH0426野生株、缺失株及互补株的菌落形态Figure5ThecolonymorphologyofA.veroniiTH0426wild，mutantandcomplementarystrainsA：野生株TH0426；B：缺失株ΔrpoN；C：互补株C-rpoN。A：WildstrainTH0426；B：MutantstrainΔrpoN；C：ComplementarystrainC-rpoN.ABC2.2rpoN互补株的鉴定为验证互补株C-rpoN是否构建成功，提取互补菌株C-rpoN的RNA（见图3A），利用引物对P4-1／P4-2验证C-rpoN，检测到912bp条带，表明C-rpoN构建成功。2.3rpoN生物学特性分析2.3.1PCR检测以16SrRNA为内参基因，检测缺失株ΔrpoN和C-rpoN中rpoN基因的表达量，野生株为对照。结果显示，从缺失株均未检测到基因表达；互补株中rpoN基因的表达量为野生株的1.5倍（见图4）。2.3.2菌落形态的观察与生长曲线的绘制菌落形态的观察结果（见图5）显示，野生株TH0426菌落呈圆形、边缘整齐、表面光滑，但缺失株ΔrpoN的菌落形态呈明显的波浪状边缘，互补株C-rpoN与野生株相比，无较大变化。生长曲线检测结果显示，缺失株ΔrpoN与野生株TH0426相比，生长速度并无明显变化（见图6）。2.3.3动物致病性的检测2.3.3.1斑马鱼半数致死量的测定结果显示，野生株TH0426对斑马鱼的LD50为（5.47±1.60）×102CFU／尾；缺失株ΔrpoN为（1.25±0.12）×104CFU／尾，缺失株ΔrpoN的LD50比野生株升高了22.9倍，毒力显著下降（P＜0.001），互补株C-rpoN的毒力较图2rpoN基因缺失株的RT-PCR验证Figure2RT-PCRverificationofrpoNgenedeletionstrainA：ΔrpoN和TH0426的RNA（1，2：缺失株ΔrpoN；3：野生株TH0426）；B：RT-PCR检测结果（1，2：缺失株ΔrpoN；3：野生株TH0426）。A：ΔrpoNandTH0426RNA（1，2：Thedelet
┫允荆?吧?闠H0426菌落呈圆形、边缘整齐、表面光滑，但缺失株ΔrpoN的菌落形态呈明显的波浪状边缘，互补株C-rpoN与野生株相比，无较大变化。生长曲线检测结果显示，缺失株ΔrpoN与野生株TH0426相比，生长速度并无明显变化（见图6）。2.3.3动物致病性的检测2.3.3.1斑马鱼半数致死量的测定结果显示，野生株TH0426对斑马鱼的LD50为（5.47±1.60）×102CFU／尾；缺失株ΔrpoN为（1.25±0.12）×104CFU／尾，缺失株ΔrpoN的LD50比野生株升高了22.9倍，毒力显著下降（P＜0.001），互补株C-rpoN的毒力较图2rpoN基因缺失株的RT-PCR验证Figure2RT-PCRverificationofrpoNgenedeletionstrainA：ΔrpoN和TH0426的RNA（1，2：缺失株ΔrpoN；3：野生株TH0426）；B：RT-PCR检测结果（1，2：缺失株ΔrpoN；3：野生株TH0426）。A：ΔrpoNandTH0426RNA（1，2：ThedeletionstrainΔrpoN；3：ThewildstrainTH0426）；B：RT-PCRdetectionresults（1，2：ThedeletionstrainΔrpoN；3：ThewildstrainTH0426）.123M123MAB5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp100bp5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp100bp图3rpoN基因互补株的鉴定Figure3IdentificationofrpoNgenecomplementA：互补株rpoN的RNA（1：C-rpoN互补株；2：TH0426）；B：互补株rpoN内侧引物的PCR检测（1：C-rpoN互补株；2：TH0426）。A：RNAofcomplementarystrainrpoN（1：C-rpoNcomplement；2：TH0426）；B：ComplementarystrainrpoNinnerprimerPCRdetection（1：C-rpoNcomplement；2：TH0426）.12M12MAB5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp100bp5000bp3000bp2000bp1500b
【参考文献】：
期刊论文
[1]以质粒为基础的同源重组技术在葡萄球菌基因敲除中的应用[J]. 武有聪,孟媛媛,丁百兴,韩海燕,瞿涤,白丽. 中国人兽共患病学报. 2019(07)
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[10]团头鲂致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及耐药性分析[J]. 张冬星,康元环,张海月,安鼎杰,单晓枫,钱爱东. 中国兽医科学. 2016(10)
本文编号：3074171
【文章来源】：中国兽医科学. 2020,50(06)北大核心
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
rpoN基因缺失株的筛选与鉴定Figure1ScreeningandidentificationofrpoNgenedeletionstrainAB250bp100bp100bp
中国兽医科学第50卷图5维氏气单胞菌TH0426野生株、缺失株及互补株的菌落形态Figure5ThecolonymorphologyofA.veroniiTH0426wild，mutantandcomplementarystrainsA：野生株TH0426；B：缺失株ΔrpoN；C：互补株C-rpoN。A：WildstrainTH0426；B：MutantstrainΔrpoN；C：ComplementarystrainC-rpoN.ABC2.2rpoN互补株的鉴定为验证互补株C-rpoN是否构建成功，提取互补菌株C-rpoN的RNA（见图3A），利用引物对P4-1／P4-2验证C-rpoN，检测到912bp条带，表明C-rpoN构建成功。2.3rpoN生物学特性分析2.3.1PCR检测以16SrRNA为内参基因，检测缺失株ΔrpoN和C-rpoN中rpoN基因的表达量，野生株为对照。结果显示，从缺失株均未检测到基因表达；互补株中rpoN基因的表达量为野生株的1.5倍（见图4）。2.3.2菌落形态的观察与生长曲线的绘制菌落形态的观察结果（见图5）显示，野生株TH0426菌落呈圆形、边缘整齐、表面光滑，但缺失株ΔrpoN的菌落形态呈明显的波浪状边缘，互补株C-rpoN与野生株相比，无较大变化。生长曲线检测结果显示，缺失株ΔrpoN与野生株TH0426相比，生长速度并无明显变化（见图6）。2.3.3动物致病性的检测2.3.3.1斑马鱼半数致死量的测定结果显示，野生株TH0426对斑马鱼的LD50为（5.47±1.60）×102CFU／尾；缺失株ΔrpoN为（1.25±0.12）×104CFU／尾，缺失株ΔrpoN的LD50比野生株升高了22.9倍，毒力显著下降（P＜0.001），互补株C-rpoN的毒力较图2rpoN基因缺失株的RT-PCR验证Figure2RT-PCRverificationofrpoNgenedeletionstrainA：ΔrpoN和TH0426的RNA（1，2：缺失株ΔrpoN；3：野生株TH0426）；B：RT-PCR检测结果（1，2：缺失株ΔrpoN；3：野生株TH0426）。A：ΔrpoNandTH0426RNA（1，2：Thedelet
┫允荆?吧?闠H0426菌落呈圆形、边缘整齐、表面光滑，但缺失株ΔrpoN的菌落形态呈明显的波浪状边缘，互补株C-rpoN与野生株相比，无较大变化。生长曲线检测结果显示，缺失株ΔrpoN与野生株TH0426相比，生长速度并无明显变化（见图6）。2.3.3动物致病性的检测2.3.3.1斑马鱼半数致死量的测定结果显示，野生株TH0426对斑马鱼的LD50为（5.47±1.60）×102CFU／尾；缺失株ΔrpoN为（1.25±0.12）×104CFU／尾，缺失株ΔrpoN的LD50比野生株升高了22.9倍，毒力显著下降（P＜0.001），互补株C-rpoN的毒力较图2rpoN基因缺失株的RT-PCR验证Figure2RT-PCRverificationofrpoNgenedeletionstrainA：ΔrpoN和TH0426的RNA（1，2：缺失株ΔrpoN；3：野生株TH0426）；B：RT-PCR检测结果（1，2：缺失株ΔrpoN；3：野生株TH0426）。A：ΔrpoNandTH0426RNA（1，2：ThedeletionstrainΔrpoN；3：ThewildstrainTH0426）；B：RT-PCRdetectionresults（1，2：ThedeletionstrainΔrpoN；3：ThewildstrainTH0426）.123M123MAB5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp100bp5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp100bp图3rpoN基因互补株的鉴定Figure3IdentificationofrpoNgenecomplementA：互补株rpoN的RNA（1：C-rpoN互补株；2：TH0426）；B：互补株rpoN内侧引物的PCR检测（1：C-rpoN互补株；2：TH0426）。A：RNAofcomplementarystrainrpoN（1：C-rpoNcomplement；2：TH0426）；B：ComplementarystrainrpoNinnerprimerPCRdetection（1：C-rpoNcomplement；2：TH0426）.12M12MAB5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp100bp5000bp3000bp2000bp1500b
【参考文献】：
期刊论文
[1]以质粒为基础的同源重组技术在葡萄球菌基因敲除中的应用[J]. 武有聪,孟媛媛,丁百兴,韩海燕,瞿涤,白丽. 中国人兽共患病学报. 2019(07)
[2]水生动物维氏气单胞菌病概述[J]. 胡安东,杨霞,张飘,程振涛,姜海波,文明. 贵州畜牧兽医. 2019(02)
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[6]维氏气单胞菌最新研究进展[J]. 康元环,张冬星,杨滨僮,张贺亮,孙武文,单晓枫,钱爱东. 中国人兽共患病学报. 2018(05)
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[8]维氏气单胞菌hfq基因敲除菌株的构建及鉴定[J]. 张霖,马香,唐鸿倩,唐燕琼,刘柱. 基因组学与应用生物学. 2019(05)
[9]固氮施氏假单胞菌RpoN蛋白对鞭毛合成的影响[J]. 李耘,刘晓东,李琴,战嵛华,燕永亮,陆伟. 中国农业科技导报. 2017(11)
[10]团头鲂致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及耐药性分析[J]. 张冬星,康元环,张海月,安鼎杰,单晓枫,钱爱东. 中国兽医科学. 2016(10)
本文编号：3074171
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