牛支原体丙酮酸脱氢酶E1亚基基因的克

发布时间：2021-03-16 00:01

　　牛支原体（Mycoplasma bovis）是牛的一种重要致病性支原体,可导致牛肺炎、乳房炎等一系列疾病。丙酮酸脱氢酶E1是生命体进行糖酵解的关键酶,而目前牛支原体丙酮酸脱氢酶E1的生物学功能研究,以及其是否可以作为牛支原体病诊断靶标的报道并不多见。本论文开展了牛支原体丙酮酸脱氢酶E1的克隆表达、单克隆抗体制备及其初步的生物学功能研究。本研究以PCR扩增获得pdhα和pdhβ基因,应用生物信息学软件对pdhα和pdhβ基因序列进行初步分析;构建原核表达质粒pET-pdhα和pET-pdhβ,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,应用Western blot及ELISA对E1?亚基和E1β亚基在细胞内的分布进行了初步研究;重组融合蛋白rPDHA免疫小鼠制备免疫脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞融合,间接ELISA检测能分泌预定抗体的阳性杂交瘤细胞并进行亚克隆筛选,同时对单克隆抗体的效价和反应特异性进行检测;利用带有GFP标签的E.coli-pdhα-gfp、E.coli-pdhβ-gfp表达菌感染NBL-4细胞,置于荧光显微镜观察黏附情况。结果显示:①pdhα与pdhβ基因序列与其他已报道的相关序列具有... 

【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Summary
外文缩略语表
第一章 文献综述
    1 牛支原体及其致病机理和诊断研究进展
        1.1 牛支原体
        1.2 牛支原体致病机理
        1.3 牛支原体相关疾病的诊断
            1.3.1 病原学诊断
            1.3.2 血清学诊断
            1.3.3 分子生物学诊断
    2 丙酮酸脱氢酶复合体及其生物学功能
        2.1 丙酮酸脱氢酶复合体的结构组成
        2.2 丙酮酸脱氢酶复合体的催化作用机理
        2.3 丙酮酸脱氢酶E1的结构及功能特性
        2.4 丙酮酸脱氢酶在支原体的相关研究
    4 本研究的目的意义
第二章 牛支原体PDH E1亚基基因的克隆及相关信息分析
    1 材料
        1.1 菌种及载体
        1.2 仪器
        1.3 试剂
            1.3.1 主要试剂
            1.3.2 试剂配制
            1.3.3 培养基配制
    2 方法
        2.1 牛支原体基因组的粗提
        2.2 pdhα 和pdhβ 基因的扩增及优化
        2.3 目的基因序列相似性及抗原表位初步预测
    3 结果
        3.1 pdhα 和pdhβ 基因的扩增及序列分析
        3.2 pdhα 和pdhβ 基因序列相似性分析结果
        3.3 E1α、E1β 亚基抗原表位初步预测结果
    4 讨论
第三章 牛支原体PDH E1亚基基因原核表达及亚细胞定位
    1 材料
        1.1 菌种、载体及试验动物
        1.2 仪器
        1.3 试剂
            1.3.1 主要试剂
            1.3.2 试剂配制
    2 方法
        2.1 原核表达载体的构建
        2.2 融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE分析
        2.3 多克隆抗体的制备
        2.4 膜蛋白提取
        2.5 E1a、β 亚基在牛支原体细胞内的分布
            2.5.1 Western-blot分析
            2.5.2 ELISA检测
    3 结果
        3.1 原核表达质粒p ET-pdhα、p ET-pdhβ 的酶切鉴定
        3.2 r PDHA及r PDHB的诱导表达
        3.3 E1a、β 亚基在牛支原体细胞内的分布
    4 讨论
第四章 牛支原体丙酮酸脱氢酶E1α 亚基单克隆抗体的制备
    1 材料
        1.1 试验动物、菌株、细胞及抗原
        1.2 仪器
        1.3 主要试剂
    2 方法
        2.1 BALB/c小鼠的免疫
        2.2 骨髓瘤细胞的培养
        2.3 饲养细胞的制备
        2.4 小鼠免疫脾细胞的制备
        2.5 确定最佳抗原包被量
        2.6 骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的融合
        2.7 杂交瘤细胞的抗体检测
        2.8 阳性杂交瘤细胞亚克隆筛选
        2.9 杂交瘤细胞的冻存与复苏
        2.10 单克隆抗体效价检测
        2.11 单克隆抗体特异性检测
        2.12 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性检测
    3 结果
        3.1 牛支原体抗原最佳包被浓度的确定
        3.2 细胞融合前小鼠尾血效价
        3.3 杂交瘤细胞株的建立
        3.4 单克隆抗体的生物学活性
            3.4.1 单克隆抗体效价
            3.4.2 单克隆抗体特异性
        3.5 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性检测
    4 讨论
第五章 牛支原体丙酮酸脱氢酶E1亚基的黏附特性研究
    1 材料
        1.1 菌株、载体与细胞
        1.2 试剂
    2 方法
        2.1 荧光表达载体的构建
        2.2 重组菌的诱导表达
        2.3 E. coli-pdhα-gfp和E. coli-pdhβ-gfp对NBL-4 细胞的黏附试验
        2.4 E. coli-pdhα-gfp和E. coli-pdhβ-gfp对NBL-4 细胞的黏附抑制试验
    3 结果
        3.1 重组表达质粒的酶切鉴定
        3.2 重组菌的诱导表达
        3.3 E. coli-pdhα-gfp、E. coli-pdhβ-gfp对NBL-4 细胞的黏附试验
        3.4 多抗血清对E. coli-pdhα-gfp、E. coli-pdhβ-gfp的黏附抑制试验
    4 讨论
全文结论
参考文献
致谢
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导师简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]滑液支原体二氢硫辛酰胺乙酰转移酶单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 郭小琴,包世俊,邢小勇,胡国明,薛慧文,温峰琴,胡永浩,项海涛.  中国兽医科学. 2015(08)
[2]山羊支原体山羊肺炎亚种单克隆抗体的制备及抗体结合抗原表位的筛选[J]. 郑莹莹,骈亚亚,储岳峰,赵萍,贺英,简莹娜,姜永强,逯忠新.  中国畜牧兽医. 2014(08)
[3]鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶E1β亚基单克隆抗体的制备和鉴定[J]. 张凡庆,谭磊,包世俊,任峰,陆凤,费荣梅,丁铲.  中国兽医科学. 2014(07)
[4]牛支原体单克隆抗体的制备与鉴定[J]. 任泽民,姜勇,巴晓亮,胡长敏,陈颖钰,彭清洁,陈焕春,郭爱珍.  中国畜牧兽医. 2012(07)
[5]绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae）丙酮酸脱氢酶E1-α亚单位基因（pdha）的克隆、表达及其免疫学活性测定[J]. 许健,储岳峰,高鹏程,赵萍,贺英,剡根强,逯忠新.  农业生物技术学报. 2012(03)
[6]3种ELISA试剂盒检测抗牛支原体抗体的比较[J]. 刘洋,陈维,宋志强,孙文静,李媛,邹小辉,辛九庆.  中国预防兽医学报. 2011(06)
[7]牛支原体、无乳支原体和丝状支原体丝状亚种小克隆三重PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 李大伟,黄灿平,张彦明,谢建华,冉智光,熊仲良,范伟兴.  畜牧兽医学报. 2011(02)
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[10]牛支原体病研究进展[J]. 胡长敏,石磊,龚瑞,白智迪,郭爱珍.  动物医学进展. 2009(08)

博士论文
[1]滑液支原体膜表面丙酮酸脱羧酶的生物学特性研究[D]. 包世俊.中国农业科学院 2014

硕士论文
[1]牛支原体p28基因的表达及间接ELISA方法的建立[D]. 刘洋.中国农业科学院 2011



本文编号：3085048