绵羊Pax7基因慢病毒示踪载体的构建与表达检测
发布时间：2021-03-18 19:58
为了探讨是否可以利用Pax7基因诱导绵羊间充质细胞为成肌细胞,试验采用RT-PCR技术从绵羊肌肉中成功克隆Pax7基因的编码区序列（CDS）后,将其连接到酶切后的空表达载体pTetOn3-DsRed上,构建诱导型慢病毒示踪载体pTetOn3-DsRed-Pax7。通过脂质体法将诱导型慢病毒示踪载体pTetOn3-DsRed-Pax7与辅助包装载体VSV-G、px和pMD共转染到293T细胞中,获得病毒上清液后侵染293T细胞,利用Western-blot技术检测侵染后细胞中Pax7基因的表达情况,验证所构建载体的有效性及Pax7基因的表达活性。结果表明:试验成功克隆得到绵羊Pax7基因的CDS及构建出诱导型慢病毒示踪载体pTetOn3-DsRed-Pax7;病毒侵染后,靶细胞经绿光（532 nm）照射可表达红色荧光;与空白对照细胞中Pax7基因的表达量相比,侵染诱导型慢病毒示踪载体pTetOn3-DsRed-Pax7的293T细胞中Pax7基因的表达量明显上升,且加入诱导物强力霉素后Pax7基因表达量显著高于未添加强力霉素的细胞。说明试验已成功构建出特异性表达绵羊Pax7基因的诱导型慢...
【文章来源】：黑龙江畜牧兽医. 2020,(19)北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
Pax7基因的PCR扩增结果
将回收得到的PCR产物与克隆载体pMD18-T连接,用限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ双酶切后,在约2 600 bp和1 600 bp处出现目的条带,见图2。说明目的基因Pax7已与克隆载体pMD18-T连接,重组克隆载体pMD18-T-Pax7构建成功。2.2 诱导型慢病毒示踪载体pTetOn3-DsRed-Pax7的构建与鉴定
使用含有限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物(Pax7-F2、Pax7-R2)对重组克隆载体pMD18-T-Pax7进行PCR扩增,并用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ对空表达载体pTetOn3-DsRed进行酶切,回收目的片段并进行连接,构建诱导型慢病毒示踪载体pTetOn3-DsRed-Pax7,对其进行PCR扩增,结果在约1 600 bp处出现特异性条带,见图3。对诱导型慢病毒示踪载体pTetOn3-DsRed-Pax7进行双酶切鉴定,结果出现2条条带,见图4。图4 诱导型慢病毒示踪载体pTetOn3-DsRed-Pax7
【参考文献】：
期刊论文
[1]草鱼PAX7基因的克隆、序列分析及组织表达[J]. 甘甜,冷向军,郭婷,胡静,魏静,李小勤. 生物技术通报. 2014(11)
本文编号：3088850
【文章来源】：黑龙江畜牧兽医. 2020,(19)北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
Pax7基因的PCR扩增结果
将回收得到的PCR产物与克隆载体pMD18-T连接,用限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ双酶切后,在约2 600 bp和1 600 bp处出现目的条带,见图2。说明目的基因Pax7已与克隆载体pMD18-T连接,重组克隆载体pMD18-T-Pax7构建成功。2.2 诱导型慢病毒示踪载体pTetOn3-DsRed-Pax7的构建与鉴定
使用含有限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物(Pax7-F2、Pax7-R2)对重组克隆载体pMD18-T-Pax7进行PCR扩增,并用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ对空表达载体pTetOn3-DsRed进行酶切,回收目的片段并进行连接,构建诱导型慢病毒示踪载体pTetOn3-DsRed-Pax7,对其进行PCR扩增,结果在约1 600 bp处出现特异性条带,见图3。对诱导型慢病毒示踪载体pTetOn3-DsRed-Pax7进行双酶切鉴定,结果出现2条条带,见图4。图4 诱导型慢病毒示踪载体pTetOn3-DsRed-Pax7
【参考文献】：
期刊论文
[1]草鱼PAX7基因的克隆、序列分析及组织表达[J]. 甘甜,冷向军,郭婷,胡静,魏静,李小勤. 生物技术通报. 2014(11)
本文编号：3088850
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