抗猪支原体HspA1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
发布时间：2021-03-28 16:37
为阐明猪支原体HspA1的生物学特性,本研究构建了重组质粒pET-28a-HspA1,原核表达HspA1重组蛋白并纯化;以纯化的HspA1蛋白免疫BALB/c雌性小鼠,通过常规方法制备单克隆抗体,利用间接ELISA方法检测单克隆抗体效价,通过Western-blot检测单克隆抗体的特异性。结果显示,本研究成功筛选出以4B4、2G2命名的2株杂交瘤细胞,其抗体分泌稳定;这2株杂交瘤细胞特异性好,与HspA1重组蛋白均能发生特异性反应;这2株杂交瘤细胞识别的抗原表位相同,单抗亚型均为Ig G1、κ链;4B4、2G2的细胞上清和腹水的ELISA抗体效价分别为:1∶3 200、1∶800和1∶13 107 200、1∶819 200。
【文章来源】：中国兽医科学. 2020,50(12)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
所示，2株杂交瘤细胞株的染色体数目均大于99，且小于108
inereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)；4：Streptococcussuis.45min；加入固定液预固定；重复固定2次，滴片，吉姆萨染色。置全自动倒置荧光显微镜（LeicaDMI-6000B）观察杂交瘤细胞染色体形态并计数。1.7.4抗体分泌稳定性及效价测定用间接ELISA法测定杂交瘤细胞效价。将4B4和2G2连续传代，并及时冻存。传至15代，取细胞上清，同时复苏冻存的杂交瘤细胞，检测抗体效价。2结果2.1抗原蛋白的制备和鉴定通过优化表达条件，成功表达HspA1蛋白，并利用带His标签的柱子纯化该蛋白。SDS-PAGE结果显示（见图1），HspA1蛋白大小约为70ku，蛋白纯化效果好。2.2间接ELISA筛选方法建立利用方阵滴定法确立抗原最佳稀释浓度为1∶800，约为0.2g/mL，阴性与阳性血清的稀释比例为1∶1600。2.3杂交瘤细胞株的筛选斑点杂交法测得小鼠血清效价均达到1∶20000，取脾细胞与SP2/0细胞融合。将筛得的杂交瘤细胞株分别命名为4B4、2G2。间接ELISA方法检测4B4、2G2的细胞上清效价分别为1∶3200、1∶800，腹水效价分别为1∶13107200、1∶819200。2.4Mab特异性鉴定Western-blot鉴定结果显示（见图2）：杂交瘤细胞株4B4、2G2均能特异性识别70ku的HspA1重组蛋白，与猪繁殖与呼吸综合征、猪链球菌抗原蛋白不发生交叉反应。2.5MAb的Ig亚型鉴定抗体亚型鉴定结果表明：4B4、2G2亚型均为：IgG1、κ链。ELISA叠加法结果表明，4B4、2G2之间的叠加系数43.9％，表明这2株杂交瘤细胞株识别的抗原表位相同（见表1）。2.6杂交瘤细胞染色体染色计数试验对4B4和2G2进行杂交瘤细胞染色体染色计数试验，结果如图3所示，2株杂交瘤细胞株的染色体数目均大于99，且小于108。小鼠及SP2/0细胞的染色体数目分别为40和68。杂交瘤细胞的染色体数目约为
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪附红细胞体HspA1与DnaJ相互作用的双分子荧光互补的研究[J]. 胡盼,米荣升,黄燕,陆珂,贾海燕,程龙,詹婷婷,宋悦,王香平,韩先干,陈兆国. 中国兽医科学. 2016(05)
[2]ELISA 叠加试验检测单克隆抗体的抗原结合位点[J]. 朱敏天,陈琪,潘芝芳,黄曼倩. 南京医学院学报. 1988(01)
硕士论文
[1]猪嗜血支原体PCR和ELISA抗体检测方法的建立与应用[D]. 张长莹.南京农业大学 2011
本文编号：3105891
【文章来源】：中国兽医科学. 2020,50(12)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
所示，2株杂交瘤细胞株的染色体数目均大于99，且小于108
inereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)；4：Streptococcussuis.45min；加入固定液预固定；重复固定2次，滴片，吉姆萨染色。置全自动倒置荧光显微镜（LeicaDMI-6000B）观察杂交瘤细胞染色体形态并计数。1.7.4抗体分泌稳定性及效价测定用间接ELISA法测定杂交瘤细胞效价。将4B4和2G2连续传代，并及时冻存。传至15代，取细胞上清，同时复苏冻存的杂交瘤细胞，检测抗体效价。2结果2.1抗原蛋白的制备和鉴定通过优化表达条件，成功表达HspA1蛋白，并利用带His标签的柱子纯化该蛋白。SDS-PAGE结果显示（见图1），HspA1蛋白大小约为70ku，蛋白纯化效果好。2.2间接ELISA筛选方法建立利用方阵滴定法确立抗原最佳稀释浓度为1∶800，约为0.2g/mL，阴性与阳性血清的稀释比例为1∶1600。2.3杂交瘤细胞株的筛选斑点杂交法测得小鼠血清效价均达到1∶20000，取脾细胞与SP2/0细胞融合。将筛得的杂交瘤细胞株分别命名为4B4、2G2。间接ELISA方法检测4B4、2G2的细胞上清效价分别为1∶3200、1∶800，腹水效价分别为1∶13107200、1∶819200。2.4Mab特异性鉴定Western-blot鉴定结果显示（见图2）：杂交瘤细胞株4B4、2G2均能特异性识别70ku的HspA1重组蛋白，与猪繁殖与呼吸综合征、猪链球菌抗原蛋白不发生交叉反应。2.5MAb的Ig亚型鉴定抗体亚型鉴定结果表明：4B4、2G2亚型均为：IgG1、κ链。ELISA叠加法结果表明，4B4、2G2之间的叠加系数43.9％，表明这2株杂交瘤细胞株识别的抗原表位相同（见表1）。2.6杂交瘤细胞染色体染色计数试验对4B4和2G2进行杂交瘤细胞染色体染色计数试验，结果如图3所示，2株杂交瘤细胞株的染色体数目均大于99，且小于108。小鼠及SP2/0细胞的染色体数目分别为40和68。杂交瘤细胞的染色体数目约为
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪附红细胞体HspA1与DnaJ相互作用的双分子荧光互补的研究[J]. 胡盼,米荣升,黄燕,陆珂,贾海燕,程龙,詹婷婷,宋悦,王香平,韩先干,陈兆国. 中国兽医科学. 2016(05)
[2]ELISA 叠加试验检测单克隆抗体的抗原结合位点[J]. 朱敏天,陈琪,潘芝芳,黄曼倩. 南京医学院学报. 1988(01)
硕士论文
[1]猪嗜血支原体PCR和ELISA抗体检测方法的建立与应用[D]. 张长莹.南京农业大学 2011
本文编号：3105891
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