利用CRISPR/Cas9系统构建猪PFKM基因定点突变细胞株
发布时间：2021-03-28 15:24
肌型磷酸果糖激酶（PFKM）是作用于果糖-6-磷酸生成果糖-1,6-双磷酸的关键调节酶,在机体葡萄糖代谢、肌肉发育等多个生物过程中起关键作用。根据猪PFKM序列结构特点设计sgRNA序列并构建CRISPR/Cas9基因敲除质粒。敲除质粒转染猪PK15细胞并经嘌呤霉素筛选,极限稀释法筛选出单细胞克隆,提取各个细胞克隆DNA,利用PCR扩增敲除区域序列,通过序列测定确定是否敲除成功,利用实时荧光定量PCR及Western blot分别检测PFKM mRNA及蛋白质表达水平。结果表明:转染CRISPR/Cas9基因敲除质粒筛选到的单细胞克隆中,有2株细胞PFKM基因序列发生基因突变,其中1个克隆为碱基插入,另1个为碱基插入、替换及缺失; qRT-PCR定量检测结果表明,筛选到1株细胞PFKM mRNA表达量下降89.41%,差异极显著。Western blot检测结果表明,与正常细胞组相比, 2组敲除细胞株中PFKM蛋白表达量分别下降78.77%、81.63%,差异显著。这一研究显示利用CRISPR/Cas9系统成功获得了2株PFKM基因敲除细胞株,为后续研究PFKM基因在猪肌肉发育、能量代...
【文章来源】：扬州大学学报(农业与生命科学版). 2020,41(04)北大核心
【文章页数】：4 页
【部分图文】：
PFKM-KO2 (A)及PFKM-KO4 (B)测序峰图
图1 PFKM-KO2 (A)及PFKM-KO4 (B)测序峰图引物退火后,将退火产物与YSY线性化CRISPR/Cas9质粒连接,将连接产物转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞中,经PCR扩增并测序,比对结果表明,目标质粒中含有sgRNA序列,说明目标质粒pPFKM-KO构建成功。
PFKM是近年来发现的糖酵解过程中一个关键的调节酶,可作用于果糖-6-磷酸生成果糖-1,6-双磷酸,这一过程是不可逆反应,对机体生长发育、器官形成具有调控作用[12]。在家畜家禽中已证明PFKM基因表达变化与肉质有直接的关联性[4]。本课题组前期也发现,不同品种猪肌肉组织中PFKM蛋白表达丰度有显著差异。本研究拟利用CRISPR/Cas9基因编辑系统筛选PFKM基因敲除细胞株,用于后续基因功能检测,在已有的调控基因表达系统中, CRISPR/Cas9基因编辑系统相比之前传统的cre-loxp基因同源重组、ZFN和TALEN基因编辑系统,载体合成简单、基因编辑效率高,因而是近年来生物学领域应用最广泛的基因编辑系统[13]。本研究首先根据PFKM基因的序列,分析其基因组DNA结构,敲除位点选择在第8外显子位置并设计PFKM sgRNA序列;在单细胞克隆的筛选过程中,为提高效率,本研究在转染36 h后,用嘌呤霉素进行筛选(时间过长会影响细胞状态,过短则会影响转染效率),可大大减少后期细胞克隆中阴性细胞克隆的比例。筛选出单细胞克隆后,首先对筛选出的单细胞克隆进行目标区域PFKM第8外显子序列扩增及测定,考虑到外显子区域敲除后不一定影响mRNA表达及蛋白的生成,因此本研究在DNA确定敲除的情况下,将筛选出的2个目标区域发生基因突变的细胞株扩大培养后分别检测PFKM mRNA及蛋白质量,其中PFKM-KO2细胞株中PFKM mRNA表达量与正常细胞株相比,未见显著变化,但蛋白质表达量明显降低,可能发生突变的区域不影响该基因的正常转录,外显子区域从第10个氨基酸(组氨酸变成苏氨酸)开始发生改变,进而影响相应蛋白质的表达。PFKM-KO4株PFKM mRNA和蛋白质水平均显著下降,可能外显子区域发生突变后,导致PFKM mRNA形成不同的拼接形式,导致转录水平降低,不能正常表达PFKM蛋白[14]。本研究在DNA、mRNA及蛋白质3个层面进行了全面检测PFKM基因敲除情况,成功筛选出2株PFKM基因敲除细胞株。
【参考文献】：
期刊论文
[1]应用CRISPR/Cas9敲除HeLa细胞DDX21基因对新城疫病毒复制的影响[J]. 武炜,王飒,孟春春,仇旭升,廖瑛,谭磊,宋翠萍,刘炜玮,孙英杰,丁铲. 畜牧兽医学报. 2019(07)
[2]小鼠MSTN shRNA设计及其活性检测[J]. 祁钰钰,杨跃飞,杨开典,鞠辉明. 扬州大学学报(农业与生命科学版). 2015(03)
[3]miRNA-143表达载体构建及表达活性检测[J]. 姜星,生安志,白立景,鞠辉明. 扬州大学学报(农业与生命科学版). 2012(03)
博士论文
[1]激活诱导胞嘧啶脱氨酶基因在斑马鱼中的功能研究[D]. 竺林.中国农业大学 2014
本文编号：3105793
【文章来源】：扬州大学学报(农业与生命科学版). 2020,41(04)北大核心
【文章页数】：4 页
【部分图文】：
PFKM-KO2 (A)及PFKM-KO4 (B)测序峰图
图1 PFKM-KO2 (A)及PFKM-KO4 (B)测序峰图引物退火后,将退火产物与YSY线性化CRISPR/Cas9质粒连接,将连接产物转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞中,经PCR扩增并测序,比对结果表明,目标质粒中含有sgRNA序列,说明目标质粒pPFKM-KO构建成功。
PFKM是近年来发现的糖酵解过程中一个关键的调节酶,可作用于果糖-6-磷酸生成果糖-1,6-双磷酸,这一过程是不可逆反应,对机体生长发育、器官形成具有调控作用[12]。在家畜家禽中已证明PFKM基因表达变化与肉质有直接的关联性[4]。本课题组前期也发现,不同品种猪肌肉组织中PFKM蛋白表达丰度有显著差异。本研究拟利用CRISPR/Cas9基因编辑系统筛选PFKM基因敲除细胞株,用于后续基因功能检测,在已有的调控基因表达系统中, CRISPR/Cas9基因编辑系统相比之前传统的cre-loxp基因同源重组、ZFN和TALEN基因编辑系统,载体合成简单、基因编辑效率高,因而是近年来生物学领域应用最广泛的基因编辑系统[13]。本研究首先根据PFKM基因的序列,分析其基因组DNA结构,敲除位点选择在第8外显子位置并设计PFKM sgRNA序列;在单细胞克隆的筛选过程中,为提高效率,本研究在转染36 h后,用嘌呤霉素进行筛选(时间过长会影响细胞状态,过短则会影响转染效率),可大大减少后期细胞克隆中阴性细胞克隆的比例。筛选出单细胞克隆后,首先对筛选出的单细胞克隆进行目标区域PFKM第8外显子序列扩增及测定,考虑到外显子区域敲除后不一定影响mRNA表达及蛋白的生成,因此本研究在DNA确定敲除的情况下,将筛选出的2个目标区域发生基因突变的细胞株扩大培养后分别检测PFKM mRNA及蛋白质量,其中PFKM-KO2细胞株中PFKM mRNA表达量与正常细胞株相比,未见显著变化,但蛋白质表达量明显降低,可能发生突变的区域不影响该基因的正常转录,外显子区域从第10个氨基酸(组氨酸变成苏氨酸)开始发生改变,进而影响相应蛋白质的表达。PFKM-KO4株PFKM mRNA和蛋白质水平均显著下降,可能外显子区域发生突变后,导致PFKM mRNA形成不同的拼接形式,导致转录水平降低,不能正常表达PFKM蛋白[14]。本研究在DNA、mRNA及蛋白质3个层面进行了全面检测PFKM基因敲除情况,成功筛选出2株PFKM基因敲除细胞株。
【参考文献】：
期刊论文
[1]应用CRISPR/Cas9敲除HeLa细胞DDX21基因对新城疫病毒复制的影响[J]. 武炜,王飒,孟春春,仇旭升,廖瑛,谭磊,宋翠萍,刘炜玮,孙英杰,丁铲. 畜牧兽医学报. 2019(07)
[2]小鼠MSTN shRNA设计及其活性检测[J]. 祁钰钰,杨跃飞,杨开典,鞠辉明. 扬州大学学报(农业与生命科学版). 2015(03)
[3]miRNA-143表达载体构建及表达活性检测[J]. 姜星,生安志,白立景,鞠辉明. 扬州大学学报(农业与生命科学版). 2012(03)
博士论文
[1]激活诱导胞嘧啶脱氨酶基因在斑马鱼中的功能研究[D]. 竺林.中国农业大学 2014
本文编号：3105793
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