猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆与序列分析

发布时间：2021-03-30 12:32

　　猪流行性腹泻病毒（PEDV）是引起猪流行性腹泻（PED）的病原,也是猪重要的肠道病原之一；本病以引起猪的急性水样腹泻、呕吐和迅速脱水为主要特征,5日龄内的仔猪感染后死亡率可达100%。因此,我国大部分猪场都会用疫苗来预防PED。但是,从2010年以来,PED突然在我国南方地区暴发并迅速传播到全国各地,给我国的养猪业造成了巨大的经济损失,而疫苗在这次的PED流行中并没有给猪群应有的保护。为了揭示猪场PED弱毒疫苗免疫失败的原因,本试验从广东、广西和湖北的3个规模化猪场得到了3株PED弱毒活疫苗,首先对3株疫苗毒株进行M基因的测序,结果显示3株疫苗毒株有两个疫苗毒株的序列完全一样,另一个毒株有1个核苷酸的突变,说明3株疫苗毒株来源相同。我们选取其中一株疫苗毒株,进行基因组全序列测定,并分析疫苗毒株与流行毒株的全序列、S、M、 N、ORF3的核苷酸和氨基酸的序列差异,从基因水平上分析猪场免疫失败的原因。遗传进化结果显示,无论在全基因组水平还是在各个基因水平,疫苗毒株与目前流行毒株的亲缘关系都很远。在全基因组水平,疫苗毒株与目前流行毒株的同源性为97.1%-97.2%；在三个结构基因S、M、N... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
縮略词表
1. 文献综述
    1.1 猪流行性腹泻概述
        1.1.1 猪流行性腹泻的危害
        1.1.2 PEDV的病原特性
        1.1.3 PEDV的培养特性
        1.1.4 PED的流行病学
        1.1.5 PED的诊断
        1.1.6 PED的治疗
    1.2 PEDV的基因组和主要蛋白的分子特征
        1.2.1 5'UTR
        1.2.2 ORF1
        1.2.3 S蛋白
        1.2.4 ORF3
        1.2.5 M蛋白
        1.2.6 E蛋白
        1.2.7 N蛋白
        1.2.8 3’UTR
    1.3 PED疫苗的研究
        1.3.1 灭活疫苗
        1.3.2 弱毒疫苗
        1.3.3 基因工程疫苗
        1.3.4 核酸疫苗
        1.3.5 转基因植物疫苗
    1.4 冠状病毒感染性克隆研究进展
2. 研究目的与意义
3. 材料与方法
    3.1 材料
        3.1.1 PEDV毒株、菌种和质粒
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器设备
        3.1.4 缓冲液及培养基
        3.1.5 本试验用的引物
    3.2 试验方法
        3.2.1 PEDV疫苗毒株的鉴定
        3.2.2 PEDV疫苗株全长cDNA的克隆
        3.2.3 PEDV N基因的克隆
        3.2.4 疫苗毒株全基因组、S、ORF3、M、N基因的序列分析比较
4. 结果及分析
    4.1 PEDV疫苗毒株的鉴定
    4.2 pMD-18T-M重组质粒鉴定
    4.3 PEDV全长cDNA的克隆
    4.4 体外转录和体内转录5’端和3’端的鉴定
        4.4.1 体外转录的PEDV 5’端和3’端的鉴定
        4.4.2 体内转录的PEDV 5’端和3’端的鉴定
    4.5 PEDV N基因的真核重组质粒的鉴定
    4.6 疫苗毒株的基因组结构及分子特征
    4.7 疫苗毒株S基因的分子特征及序列分析
    4.8 疫苗毒株OFR3基因的分子特征及序列分析
    4.9 疫苗毒株M基因的分子特征及序列分析
    4.10 疫苗毒株N基因的分子特征及序列分析
5. 讨论
    5.1 疫苗毒株的同源性分析
    5.2 关于疫苗毒株与参考毒株的全序列分析
    5.3 关于S基因的序列分析
    5.4 关于ORF3的序列分析
    5.5 关于M基因的序列分析
    5.6 关于N基因的序列分析
    5.7 关于PEDV感染性克隆的构建
6. 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析[J]. 吕茂杰,陈建飞,时洪艳,陈小金,范秀萍,申识川,冯力.  微生物学报. 2011(05)
[2]猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J]. 张坤,何启盖.  畜牧兽医学报. 2010(08)
[3]表达猪流行性腹泻病毒中和抗原位点的重组干酪乳杆菌免疫小鼠诱导的免疫应答[J]. 葛俊伟,姜艳平,汪淼,乔薪瑗,刘敏,唐丽杰,李一经.  中国兽医科学. 2010(07)
[4]表面表达猪流行性腹泻病毒核蛋白蛋白的重组干酪乳杆菌诱导产生的免疫应答[J]. 葛俊伟,姜艳平,汪淼,乔薪瑗,刘敏,唐丽杰,李一经.  生物工程学报. 2009(06)
[5]猪流行性腹泻病毒S蛋白受体结合域的分析[J]. 孙东波,陈建飞,时洪艳,申识川,吕茂杰,范秀萍,陈洪岩,冯力.  畜牧兽医学报. 2009(04)
[6]猪流行性腹泻病毒S1蛋白在干酪乳杆菌中的分泌表达及免疫原性分析[J]. 葛俊伟,姜艳平,汪淼,乔薪瑗,徐义刚,唐丽杰,李一经.  中国预防兽医学报. 2009(04)
[7]猪流行性腹泻病毒纤突蛋白基因克隆与序列分析[J]. 李建强,柳纪省,兰喜,程杰,杨敏,吴润,殷相平,李宝玉,李学瑞,杨彬.  农业生物技术学报. 2007(04)
[8]猪流行性腹泻病毒分子生物学研究进展[J]. 孙东波,冯力,时洪艳,陈建飞.  动物医学进展. 2006(10)
[9]冠状病毒全长cDNA感染性克隆研究进展[J]. 赵卓.  国外医学.病毒学分册. 2004(04)
[10]流行性乙型脑炎病毒（JEV）全长感染性克隆的制备及恢复病毒的获得[J]. 黄莺,贾丽丽,孙志伟,王志伟,俞炜源,俞永新.  病毒学报. 2003(04)

硕士论文
[1]猪流行性腹泻病毒重组沙门氏菌的构建及免疫原性分析[D]. 徐丽丽.华中农业大学 2011
[2]猪传染性胃肠炎和流行性腹泻二联核酸疫苗免疫效力研究[D]. 孟凡丹.东北农业大学 2011



本文编号：3109512