奶牛瘤胃中活性尿素分解菌群多样性分析
发布时间：2021-04-02 04:13
瘤胃尿素分解菌分泌的脲酶可以水解尿素为氨,氨可被微生物吸收利用,合成微生物蛋白,所以尿素分解菌在尿素氮循环中发挥关键作用。基于体外培养和以gDNA为靶标的测序技术已经对瘤胃尿素分解菌群多样性进行了探究,但是,这些结果仅解决了瘤胃中存在哪些尿素分解菌的问题,而没有阐明正在发挥功能的活性尿素分解菌群及其多样性。本研究的目的是基于RNA测序揭示瘤胃中具有活性的尿素分解菌群多样性。为了从瘤胃微生物中提取高质量的RNA,本研究对样品前处理方法进行了优化。试验共优化四个前处理条件:瘤胃液样品形式、样品保存形式、解冻处理和研磨温度,组合形成五个处理组:（1）微生物菌体加RNA保护液液氮冷冻研磨、（2）微生物菌体液氮保存液氮冷冻研磨、（3）微生物菌体液氮保存常温研磨、（4）瘤胃内容物液氮保存液氮冷冻研磨、（5）瘤胃内容物液氮保存解冻收集菌体液氮冷冻研磨。每组设置3个重复,检测RNA浓度和完整度（RIN）。结果表明,瘤胃液样品形式对RNA浓度和RIN差异不显著;液氮保存的样品提取的RNA浓度和RIN均显著高于RNA保护液保存的样品;解冻处理对RNA浓度差异不显著,但是会降低RIN;研磨温度对RIN没有显...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
胃肠道扩增子测序研究程序Fig1Gastrointestinalampliconsequencingprogram利用扩增子测序的方法，已对瘤胃微生物功能基因信息有了新的认识
中国农业科学院硕士学位论文第二章瘤胃微生物RNA提取中样品前处理方法的优化10浓度影响有显著差异（P<0.05）。对比处理组D和E，说明解冻处理对RNA浓度影响没有显著差异。对比处理组B和C，瘤胃菌体在常温环境下研磨得到的RNA的浓度为418.67ng/μL。冷冻研磨比常温研磨提取RNA浓度高46.6%，显著高于在常温研磨的方法（P<0.05）。研磨温度对RNA浓度影响有显著差异。2.2.2总RNA完整度对比处理组B和E，液氮环境下冷冻研磨破碎瘤胃菌体和瘤胃内容物，总RNARIN值分别为8.4和9.4，差异不显著（P>0.05）（图2）。处理瘤胃液样品形式对RNA完整度影响差异不显著。对比处理组A和B，添加RNA保护液提取总RNARIN值为2.8。液氮保存的样品提取RNA完整度极显著高于液氮保存的样品（P<0.05）。处理保存形式对RNA完整度影响有极显著。对比处理组D和E，解冻后收集菌体提取RNARIN值为5.5。不解冻处理所提取的RNA完整度（P<0.05）显著高于解冻处理，解冻处理对RNA完整度影响有显著差异。对比处理组B和C，分别在常温和液氮环境下破碎瘤胃菌体，RNARIN值分别为8.4和8.3，差异不显著（P>0.05），研磨温度对RNA完整度影响差异不显著。图2瘤胃液不同前处理条件对总RNA浓度的影响Fig.2EffectofdifferentpretreatmentconditionsontotalRNAconcentrationA微生物菌体加入RNA保护液冷冻研磨B微生物菌体液氮保存冷冻研磨C微生物菌体液氮保存常温研磨D瘤胃内容物液氮保存解冻后收集菌体冷冻研磨E瘤胃内容物液氮保存冷冻研磨，a-c字母不同表示差异显著（P<0.05）AFreezehomogenizationofBacteriawithRNAProtectiveSolutionBFreezehomogenizationofBacteriawithliquidnitrogenCRoomtemperaturehomogenizationofBacteriawithliquidnitrogenDLiquidnitrogenandhomogenizationofrum
中国农业科学院硕士学位论文第二章瘤胃微生物RNA提取中样品前处理方法的优化11图3瘤胃液不同前处理条件对总RNA完整度的影响Fig.3EffectsofdifferentpretreatmentconditionsontheintegrityoftotalRNAA微生物菌体加入RNA保护液冷冻研磨B微生物菌体液氮保存冷冻研磨C微生物菌体液氮保存常温研磨D瘤胃内容物液氮保存解冻后收集菌体冷冻研磨E瘤胃内容物液氮保存冷冻研磨，a-d字母不同表示差异显著（P<0.05）AFreezehomogenizationofBacteriawithRNAProtectiveSolutionBFreezehomogenizationofBacteriawithliquidnitrogenCRoomtemperaturehomogenizationofBacteriawithliquidnitrogenDLiquidnitrogenandhomogenizationofrumencontentsafterliquidnitrogenstorageandthawingEFreezehomogenizationofrumencontentswithliquidnitrogen,Significantdifferenceindifferentrepresentationsofa-dletters（P<0.05）2.3讨论浓度和RIN是评价RNA的两个重要指标。RIN值用来评估RNA的完整性，它是由核糖体条带的比值和RNA样品的整个电泳轨迹决定的(SCHROEDERetal.,2006)。RIN值为10表示一个完整的RNA样本，RIN值大于8的样本符合转录组文库构建要求，可进行下游试验(LIetal.,2012)。环境或胃肠道样品的RNA很容易被RNA酶降解，它的提取是一项具有挑战性的任务。RNA酶广泛而稳定存在，耐受多种处理而不被灭活，如煮沸，高压灭菌。在实验中，要严格控制外源RNA酶的污染，同时也要最大限度的抑制内源性RNA酶。本研究描述了不同的瘤胃液前处理方法对提取RNA浓度与完整度的影响，找到了一种分离提取高质量、高代表性的瘤胃微生物RNA的快速有效方法。本试验发现收集瘤胃内容物或瘤胃微生物菌体得到的RNA浓度和完整度都没有显著差异。但是采集瘤胃微生物菌体需要采样现场配置
本文编号：3114565
【文章来源】：中国农业科学院北京市
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【学位级别】：硕士
【部分图文】：
胃肠道扩增子测序研究程序Fig1Gastrointestinalampliconsequencingprogram利用扩增子测序的方法，已对瘤胃微生物功能基因信息有了新的认识
中国农业科学院硕士学位论文第二章瘤胃微生物RNA提取中样品前处理方法的优化10浓度影响有显著差异（P<0.05）。对比处理组D和E，说明解冻处理对RNA浓度影响没有显著差异。对比处理组B和C，瘤胃菌体在常温环境下研磨得到的RNA的浓度为418.67ng/μL。冷冻研磨比常温研磨提取RNA浓度高46.6%，显著高于在常温研磨的方法（P<0.05）。研磨温度对RNA浓度影响有显著差异。2.2.2总RNA完整度对比处理组B和E，液氮环境下冷冻研磨破碎瘤胃菌体和瘤胃内容物，总RNARIN值分别为8.4和9.4，差异不显著（P>0.05）（图2）。处理瘤胃液样品形式对RNA完整度影响差异不显著。对比处理组A和B，添加RNA保护液提取总RNARIN值为2.8。液氮保存的样品提取RNA完整度极显著高于液氮保存的样品（P<0.05）。处理保存形式对RNA完整度影响有极显著。对比处理组D和E，解冻后收集菌体提取RNARIN值为5.5。不解冻处理所提取的RNA完整度（P<0.05）显著高于解冻处理，解冻处理对RNA完整度影响有显著差异。对比处理组B和C，分别在常温和液氮环境下破碎瘤胃菌体，RNARIN值分别为8.4和8.3，差异不显著（P>0.05），研磨温度对RNA完整度影响差异不显著。图2瘤胃液不同前处理条件对总RNA浓度的影响Fig.2EffectofdifferentpretreatmentconditionsontotalRNAconcentrationA微生物菌体加入RNA保护液冷冻研磨B微生物菌体液氮保存冷冻研磨C微生物菌体液氮保存常温研磨D瘤胃内容物液氮保存解冻后收集菌体冷冻研磨E瘤胃内容物液氮保存冷冻研磨，a-c字母不同表示差异显著（P<0.05）AFreezehomogenizationofBacteriawithRNAProtectiveSolutionBFreezehomogenizationofBacteriawithliquidnitrogenCRoomtemperaturehomogenizationofBacteriawithliquidnitrogenDLiquidnitrogenandhomogenizationofrum
中国农业科学院硕士学位论文第二章瘤胃微生物RNA提取中样品前处理方法的优化11图3瘤胃液不同前处理条件对总RNA完整度的影响Fig.3EffectsofdifferentpretreatmentconditionsontheintegrityoftotalRNAA微生物菌体加入RNA保护液冷冻研磨B微生物菌体液氮保存冷冻研磨C微生物菌体液氮保存常温研磨D瘤胃内容物液氮保存解冻后收集菌体冷冻研磨E瘤胃内容物液氮保存冷冻研磨，a-d字母不同表示差异显著（P<0.05）AFreezehomogenizationofBacteriawithRNAProtectiveSolutionBFreezehomogenizationofBacteriawithliquidnitrogenCRoomtemperaturehomogenizationofBacteriawithliquidnitrogenDLiquidnitrogenandhomogenizationofrumencontentsafterliquidnitrogenstorageandthawingEFreezehomogenizationofrumencontentswithliquidnitrogen,Significantdifferenceindifferentrepresentationsofa-dletters（P<0.05）2.3讨论浓度和RIN是评价RNA的两个重要指标。RIN值用来评估RNA的完整性，它是由核糖体条带的比值和RNA样品的整个电泳轨迹决定的(SCHROEDERetal.,2006)。RIN值为10表示一个完整的RNA样本，RIN值大于8的样本符合转录组文库构建要求，可进行下游试验(LIetal.,2012)。环境或胃肠道样品的RNA很容易被RNA酶降解，它的提取是一项具有挑战性的任务。RNA酶广泛而稳定存在，耐受多种处理而不被灭活，如煮沸，高压灭菌。在实验中，要严格控制外源RNA酶的污染，同时也要最大限度的抑制内源性RNA酶。本研究描述了不同的瘤胃液前处理方法对提取RNA浓度与完整度的影响，找到了一种分离提取高质量、高代表性的瘤胃微生物RNA的快速有效方法。本试验发现收集瘤胃内容物或瘤胃微生物菌体得到的RNA浓度和完整度都没有显著差异。但是采集瘤胃微生物菌体需要采样现场配置
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