猪瘟野毒株的分离鉴定及与疫苗株的HRM鉴别方法的建立

发布时间：2021-04-03 23:51

　　本研究从广东湛江、清远和山西太原3个地区分离出13株猪瘟阳性毒株，选择基因分型最可靠的NS5B区域，设计一对扩增片段大小为965bp的引物。基因相似性分析表明，同一地区分离的毒株相似性高，可达99.7%。猪瘟分离株与基因2型参考野毒株（HQ148063）序列相似性最高（95.8%），与3型猪瘟毒株（L49347）相似性最低（84.3%）。CSFV分离株与基因2型参考野毒株（HQ148063）基因推导的氨基酸相似性最高（95.7%），与基因3型参考野毒株（L49347）氨基酸相似性最低（84.0%）。遗传进化分析中，本研究中分离的猪瘟毒株均属于基因2型。为建立一种简便快速鉴别猪瘟野毒与疫苗弱毒的分子诊断方法，本研究基于HRM检测技术对临床样本进行了PCR-HRM分析。参考NCBI中收入的29株野毒株与9株疫苗株基因序列进行多序列比对分析和在线模拟筛选，在3′UTR区设计一对扩增片段大小为200bp左右的引物。分别以猪瘟分离株和兔化弱毒疫苗株的mRNA为模板，在反应前加入LC饱和荧光染料进行RT-PCR扩增，并对扩增产物进行HRM分析。HRM曲线图显示两种毒株在70℃-90℃温度范围内均有... 

【文章来源】：江西农业大学江西省

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
前言
第一章 研究综述
    1 猪瘟病毒
        1.1 猪瘟病毒分子生物学特征
            1.1.1 CSFV 基因组编码的结构蛋白及其功能
            1.1.2 CSFV 基因组编码的非结构蛋白及功能
            1.1.3 非编码区及特性
            1.1.4 CSFV 基因分型
        1.2 猪瘟流行病学状况
        1.3 常用的猪瘟疫苗
            1.3.1 猪瘟标记疫苗
            1.3.2 猪瘟弱毒疫苗
        1.4 猪瘟实验室诊断技术
            1.4.1 CSFV 常规实验室诊断技术
            1.4.2 CSFV 分子诊断技术
            1.4.3 猪瘟野毒株与疫苗株的鉴别诊断
    2 高分辨率溶解曲线
        2.1 适用于 HRM 的染料和仪器
        2.2 HRM 的运用
    3 本研究目的与意义
第二章 猪瘟野毒株分离鉴定及与疫苗株 HRM 鉴别诊断
    1 材料
        1.1 病料的收集
        1.2 主要试验试剂
        1.3 宿主菌和质粒载体
        1.4 试验所需溶液的配置
        1.5 主要试验器材
        1.6 参考的基因序列
    2 方法
        2.1 HRM 在线模拟和引物设计
        2.2 血液、组织中病毒核酸的提取
        2.3 反转录和 PCR 扩增
            2.3.1 RNA 反转录
            2.3.2 PCR 扩增反应
        2.4 目的片段的克隆
            2.4.1 PCR 产物的回收
            2.4.2 目的片段与 pMD-18T 克隆载体的连接
            2.4.3 TOP10 感受态细胞的制备
            2.4.4 重组质粒的转化
            2.4.5 阳性菌落的筛选、鉴定
            2.4.6 重组质粒的提取
        2.5 目的片段测序和序列分析
        2.6 CSFV 野毒株与疫苗株 HRM 分析
            2.6.1 野毒株与疫苗株 3′UTR 基因 HRM 溶解曲线分析
            2.6.2 特异性试验分析
            2.6.3 敏感性试验分析
            2.6.4 重复性试验分析
            2.6.5 野毒株与疫苗株混合感染模拟
    3 结果与分析
        3.1 NS5B 和 3′UTR 区域 PCR 扩增结果
            3.1.1 NS5B 区域 PCR 扩增结果
            3.1.2 猪瘟 3′UTR 区域 PCR 扩增结果
        3.2 CSFV 测序序列和代表株的 NS5B 基因分析
            3.2.1 NS5B 基因相似性分析
            3.2.2 NS5B 基因遗传进化分析
        3.3 CSFV 3′UTR 基因部分序列的分析
        3.4 CSFV 病毒分离株与疫苗株 HRM 分析
            3.4.1 病毒分离株和疫苗株 HRM 鉴别分析
            3.4.2 PCR-HRM 敏感性分析
        3.5 CSFV 3′UTR 区特异序列 HRM 模拟分析
            3.5.1 参考株与实验分离株模拟曲线分析
            3.5.2 HRM 动力模拟曲线分析
        3.6 野毒株与疫苗株混合感染模拟
    4 讨论
        4.1 猪瘟分离株基因序列特征
        4.2 猪瘟野毒株与疫苗弱毒株的 HRM 鉴别
        4.3 猪瘟 HRM 模拟分析
        4.4 猪瘟野毒株与疫苗弱毒株混合感染分析
    5 结论
第三章 HRM 分析方法中不同核酸片段、染料和仪器的比较
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
            1.1.1 试验试剂与样品
            1.1.2 主要试验器材
        1.2 RNA 病毒（CSFV 和 ALV）反转录
        1.3 质粒的构建
        1.4 溶解曲线在线模拟
        1.5 不同扩增片段的 PCR-HRM 方法建立
        1.6 不同染料的 HRM 比较
        1.7 不同仪器之间的 HRM 比较
    2 结果与分析
        2.1 PCR 扩增产物凝胶电泳结果
        2.2 核酸序列熔解曲线模拟结果
        2.3 不同染料和扩增片段对 HRM 结果的影响
        2.4 不同仪器对 HRM 结果的影响
    3 讨论
        3.1 不同扩增片段对 HRM 分析的影响
        3.2 不同核酸染料对 HRM 分析的影响
        3.3 不同仪器对 HRM 分析影响
    4 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3117319