羊驼免疫库的制备及抗孔雀石绿纳米抗体的筛选
发布时间：2021-04-04 00:18
孔雀石绿（malachite green,MG）是一种易溶于水和乙醇等的基础染料,可在多种行业应用,并曾用于水生动物多种疾病如真菌病、寄生虫病、细菌性疾病等的治疗。但因其具有致癌等毒副作用,目前已被禁用。然而市场上仍有在水产品违法使用MG的现象,因此需要加强对该药品残留的检测。本研究选择羊驼免疫库筛选抗MG纳米抗体,通过噬菌体ELISA筛选高亲和力和特异性的纳米抗体。通过辅助噬菌体M13的救援,使得纳米抗体基因（VHH）与噬菌体外壳蛋白基因融合表达,从而使得VHH蛋白展示在噬菌体表面,通过有限稀释筛选和多次洗脱的办法,获得含有目的基因的单个噬菌克隆;将重组质粒PMES4-VHH转化到表达细胞中,进行体外表达。最后采用NI-NTA柱进行His标签纯化,得到抗MG纳米抗体,并进行SDS-PAGE电泳鉴定。结果显示:噬菌体文库成功构建,库容为3.2×108 cfu/mL;通过ELISA筛选,得到16个具有抑制效果的噬菌体克隆,经对噬菌体基因测序并翻译,得到2种氨基酸序列;将重组质粒转化至表达菌株表达、纯化,最后得到大小约为15 kDa的抗MG纳米抗体,从而为MG的下一步...
【文章来源】：中国动物检疫. 2020,37(12)
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
总RNA琼脂糖凝胶电泳结果
采用巢氏PCR扩增羊驼全部VHH基因。第1轮PCR扩增，采用前导区序列引物CALL001和恒定区序列引物CALL002进行，结果扩增得到600 bp和1 000 bp两个条带（图2-A）；收集全部PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后用DNA胶回收试剂盒，切胶纯化600 bp的PCR产物并备用。第2轮PCR扩增，以切胶回收产物为模板，以VHH-F和VHH-R为引物，结果扩增得到约350 bp的产物（图2-B）。采用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物，经微量核酸测定仪定量后置于-20℃冻存备用。2.3 纳米抗体文库建立
用限制性内切酶PstⅠ和Bst EⅡ对巢式PCR纯化后的扩增产物和噬菌粒载体PMES4进行双酶切，经电转化、菌液涂布平板后，平板计数测得所构建的噬菌体文库菌落数达3.2×108 cfu/m L（图3）。随机从文库菌落计数的平板上挑取20个单菌落，通过PCR鉴定VHH基因的插入率。结果（图4）显示，试验组中20个单菌落均特能异性扩增出约350 bp的条带，表明该文库的克隆效率高达100%，由此可知噬菌体文库的库容为3.2×108 cfu/m L。
【参考文献】：
期刊论文
[1]抗犬瘟热病毒VHH抗体噬菌体库的构建与筛选[J]. 王召阳,蒋亚君,刘雪婷,林伟东,鑫婷,侯绍华,郭晓宇,朱鸿飞,贾红. 中国畜牧兽医. 2020(06)
[2]超高效液相色谱-串联质谱法检测鱼类中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物[J]. 师真,李文廷,张瑞雨,欧利华,梁孟军,赵丽. 食品安全质量检测学报. 2020(09)
[3]2017～2019年昆明市市售食用鱼中几种违禁药物分析[J]. 师真,赵俊丽,李文廷,梁志坚,马晓年,赵丽. 食品安全质量检测学报. 2020(06)
[4]对硫磷纳米抗体筛选及分子识别机制研究[J]. 张玉琪,张瑾如,王锋,李家冬,司睿,吕丽珊,沈玉栋,王弘,HAMMOCK Bruce D,孙远明. 分析化学. 2019(09)
[5]2013—2018年湛江进出口水产品兽药残留结果分析[J]. 林锏锐,唐媛媛,詹海毅,马聪,伍志强,李昉. 检验检疫学刊. 2019(03)
[6]2018年陕西省水产品中4种兽药残留的风险分析[J]. 范芳芳,樊成,魏宁果. 农产品加工. 2019(11)
[7]水产品中孔雀石绿快速检测产品质量评估[J]. 苑婷婷,储成群,肖毅美,黄彬昌,李金燕. 山东化工. 2018(15)
[8]模拟运输条件下孔雀石绿及其代谢物在鳜体内的残留消除规律[J]. 李丽春,刘书贵,尹怡,马丽莎,单奇,戴晓欣,郑光明. 中国渔业质量与标准. 2016(06)
[9]水产品中孔雀石绿残留的毒性作用及风险评估[J]. 胡浩光,刘少彬,李绪鹏,彭家杰. 农业与技术. 2016(19)
[10]孔雀石绿及其代谢物隐性孔雀石绿在鲫鱼组织中的分布及消除情况研究[J]. 银旭红,谢世红,徐节华,欧阳敏,李彩刚. 江西水产科技. 2016(03)
硕士论文
[1]草鱼体内孔雀石绿代谢规律及残留分析[D]. 薛燕妮.华南农业大学 2016
[2]重金属Cd纳米抗体的制备及其免疫学检测方法的建立与应用[D]. 姜忍忍.上海师范大学 2014
本文编号：3117360
【文章来源】：中国动物检疫. 2020,37(12)
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
总RNA琼脂糖凝胶电泳结果
采用巢氏PCR扩增羊驼全部VHH基因。第1轮PCR扩增，采用前导区序列引物CALL001和恒定区序列引物CALL002进行，结果扩增得到600 bp和1 000 bp两个条带（图2-A）；收集全部PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后用DNA胶回收试剂盒，切胶纯化600 bp的PCR产物并备用。第2轮PCR扩增，以切胶回收产物为模板，以VHH-F和VHH-R为引物，结果扩增得到约350 bp的产物（图2-B）。采用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物，经微量核酸测定仪定量后置于-20℃冻存备用。2.3 纳米抗体文库建立
用限制性内切酶PstⅠ和Bst EⅡ对巢式PCR纯化后的扩增产物和噬菌粒载体PMES4进行双酶切，经电转化、菌液涂布平板后，平板计数测得所构建的噬菌体文库菌落数达3.2×108 cfu/m L（图3）。随机从文库菌落计数的平板上挑取20个单菌落，通过PCR鉴定VHH基因的插入率。结果（图4）显示，试验组中20个单菌落均特能异性扩增出约350 bp的条带，表明该文库的克隆效率高达100%，由此可知噬菌体文库的库容为3.2×108 cfu/m L。
【参考文献】：
期刊论文
[1]抗犬瘟热病毒VHH抗体噬菌体库的构建与筛选[J]. 王召阳,蒋亚君,刘雪婷,林伟东,鑫婷,侯绍华,郭晓宇,朱鸿飞,贾红. 中国畜牧兽医. 2020(06)
[2]超高效液相色谱-串联质谱法检测鱼类中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物[J]. 师真,李文廷,张瑞雨,欧利华,梁孟军,赵丽. 食品安全质量检测学报. 2020(09)
[3]2017～2019年昆明市市售食用鱼中几种违禁药物分析[J]. 师真,赵俊丽,李文廷,梁志坚,马晓年,赵丽. 食品安全质量检测学报. 2020(06)
[4]对硫磷纳米抗体筛选及分子识别机制研究[J]. 张玉琪,张瑾如,王锋,李家冬,司睿,吕丽珊,沈玉栋,王弘,HAMMOCK Bruce D,孙远明. 分析化学. 2019(09)
[5]2013—2018年湛江进出口水产品兽药残留结果分析[J]. 林锏锐,唐媛媛,詹海毅,马聪,伍志强,李昉. 检验检疫学刊. 2019(03)
[6]2018年陕西省水产品中4种兽药残留的风险分析[J]. 范芳芳,樊成,魏宁果. 农产品加工. 2019(11)
[7]水产品中孔雀石绿快速检测产品质量评估[J]. 苑婷婷,储成群,肖毅美,黄彬昌,李金燕. 山东化工. 2018(15)
[8]模拟运输条件下孔雀石绿及其代谢物在鳜体内的残留消除规律[J]. 李丽春,刘书贵,尹怡,马丽莎,单奇,戴晓欣,郑光明. 中国渔业质量与标准. 2016(06)
[9]水产品中孔雀石绿残留的毒性作用及风险评估[J]. 胡浩光,刘少彬,李绪鹏,彭家杰. 农业与技术. 2016(19)
[10]孔雀石绿及其代谢物隐性孔雀石绿在鲫鱼组织中的分布及消除情况研究[J]. 银旭红,谢世红,徐节华,欧阳敏,李彩刚. 江西水产科技. 2016(03)
硕士论文
[1]草鱼体内孔雀石绿代谢规律及残留分析[D]. 薛燕妮.华南农业大学 2016
[2]重金属Cd纳米抗体的制备及其免疫学检测方法的建立与应用[D]. 姜忍忍.上海师范大学 2014
本文编号：3117360
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