拟蜘蛛牵丝蛋白基因细毛羊毛囊特异表达载体的构建及其转基因细胞系的建立
发布时间：2021-04-05 10:22
蜘蛛丝是自然界具有最优异力学性能的生物纤维,主要成分为蛛丝蛋白,但是难以大量生产或收集。利用基因工程手段可实现蛛丝蛋白基因转入异源宿主中并表达。本实验通过脂质体转染法将蜘蛛牵丝蛋白基因真核表达载体pK-2S转入美利奴细毛羊胎儿皮肤成纤维细胞中,筛选稳定转入蛛丝蛋白基因的细胞株,通过DNA,RNA水平的检测初步鉴定基因是否转入细胞并表达,为培育能生产含有蛛丝蛋白羊毛的绵羊新品种奠定基础。主要结果如下：1.以已发表的棒络新妇蛛cDNA片段为模板,人工合成拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体（S）,并获得二聚体（2S）。2.建立了新疆美利奴细毛羊胎儿成纤维细胞系,细胞形态观察显示细胞形态良好,生长曲线表明细胞增殖状态较好,核型分析正常。3.克隆了绵羊毛囊特异性表达启动子Kap6.1,构建表达载体pKap-EGFP并转入细毛羊胎儿皮肤成纤维细胞中并表达绿色荧光蛋白,表明启动子具有表达活性。4.以pEGFP-N1为框架,将2S与绵羊毛囊特异性启动子Kap6.1相连,构建毛囊特异表达载体pK-2S。5.质粒pK-2S线性化后,转染新疆美利奴细毛羊胎儿皮肤成纤维细胞,并通过600μg/mL G418筛选单克隆。提...
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
无缝克隆法步驟Figl：ProcedureofoneStepCloning
回收载体片段3.2kb。然后将载体片段与目的基因进行连接、转化、质粒提取和酶切鉴定（见图5)，结果切出l.lkb目的片段，获得拟蛛牵丝蛋白基因二聚体（2S)。bp M 1 22000麵750500 H|^KH100图5载体pUC57-2S酶切鉴定Fig.5 Identification of pUC57-2S by enzyme digestion注:M.DL2000;1，2.酶切产物，2.3讨论目前，人们所获得的购蛛丝基因序列都是通过蛋白水解获得肽段，通过肽段获得其cDNA序列合成基因，尚未有_蛛全基因组测序完成的报道，因此分离获得全长的妹丝蛋白编码基因比较困难。蛛丝蛋白的氨基酸组成主要包括甘氨酸和丙氨酸
较远处为成纤维细胞；接种5d-6d后，组织块周围游离出的成纤维细胞已汇合成片（如图6中A)，从生长状况可以看出细胞活力较好，形态健康，达到一定浓度后，进行消化传代。通常以1:3的比例进行传代，传代后的细胞一般约2d-3d己长满单层，可进行再传代。根据成纤维细胞与上皮样细胞对胰蛋白酶的敏感性不同进行成纤维细胞的纯化，上皮样细胞一般需要5niin以上才会从瓶底脱落，因此，在传代时控制消化时间，保持Imin左右，经过2-3次的传代即获得较纯的成纤维细胞（如图6中B图）。前十代细胞生长速度快，活力旺盛，形态较好，细胞复苏后一般会有少量细胞死亡，换液后继续培养
【参考文献】：
期刊论文
[1]SD大鼠超排及TALEN质粒显微注射构建基因敲除大鼠[J]. 卞洲艳,杨政,徐蔓,张洁钰,廖海含,唐其柱. 海南医学. 2013(21)
[2]一种载体构建的新方法:重组融合PCR法[J]. 邝翡婷,袁定阳,李莉,李新奇. 基因组学与应用生物学. 2012(06)
[3]中国蜘蛛目研究进展[J]. 万莉,朱明生. 黑龙江科技信息. 2012(10)
[4]脂质体转染巴马猪胎儿成纤维细胞条件的优化[J]. 粟文俊,蒋泓,唐冬生,洪亚辉. 中国农学通报. 2011(07)
[5]一种稳定且高效的磷酸钙293T细胞转染法[J]. 唐蓓. 生物技术. 2011(01)
[6]蜘蛛丝的结构与机械性能研究进展[J]. 蒋平,肖永红,吕太勇,廖信军. 井冈山大学学报(自然科学版). 2010(04)
[7]动物转基因及克隆技术研究[J]. 余华,叶健强,刘丹. 信阳农业高等专科学校学报. 2009(02)
[8]一种载体构建的新方法:一步克隆法[J]. 欧阳平,李玉,严红,马立新. 湖北大学学报(自然科学版). 2007(02)
[9]古老的进化物种 奇异的蜘蛛世界[J]. 胡喜海. 中学生物学. 2007(03)
[10]慢病毒载体介导IκB激酶-α（IKKα）基因RNA干扰转基因小鼠的制备[J]. 杨志峰,王龙,杨生生,匡颖,陈欢,徐国江,蔡在龙,王铸钢,毛积芳. 生物化学与生物物理进展. 2007(02)
硕士论文
[1]脂质体转染制备转基因鹌鹑的研究[D]. 李艳.石河子大学 2013
本文编号：3119454
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
无缝克隆法步驟Figl：ProcedureofoneStepCloning
回收载体片段3.2kb。然后将载体片段与目的基因进行连接、转化、质粒提取和酶切鉴定（见图5)，结果切出l.lkb目的片段，获得拟蛛牵丝蛋白基因二聚体（2S)。bp M 1 22000麵750500 H|^KH100图5载体pUC57-2S酶切鉴定Fig.5 Identification of pUC57-2S by enzyme digestion注:M.DL2000;1，2.酶切产物，2.3讨论目前，人们所获得的购蛛丝基因序列都是通过蛋白水解获得肽段，通过肽段获得其cDNA序列合成基因，尚未有_蛛全基因组测序完成的报道，因此分离获得全长的妹丝蛋白编码基因比较困难。蛛丝蛋白的氨基酸组成主要包括甘氨酸和丙氨酸
较远处为成纤维细胞；接种5d-6d后，组织块周围游离出的成纤维细胞已汇合成片（如图6中A)，从生长状况可以看出细胞活力较好，形态健康，达到一定浓度后，进行消化传代。通常以1:3的比例进行传代，传代后的细胞一般约2d-3d己长满单层，可进行再传代。根据成纤维细胞与上皮样细胞对胰蛋白酶的敏感性不同进行成纤维细胞的纯化，上皮样细胞一般需要5niin以上才会从瓶底脱落，因此，在传代时控制消化时间，保持Imin左右，经过2-3次的传代即获得较纯的成纤维细胞（如图6中B图）。前十代细胞生长速度快，活力旺盛，形态较好，细胞复苏后一般会有少量细胞死亡，换液后继续培养
【参考文献】：
期刊论文
[1]SD大鼠超排及TALEN质粒显微注射构建基因敲除大鼠[J]. 卞洲艳,杨政,徐蔓,张洁钰,廖海含,唐其柱. 海南医学. 2013(21)
[2]一种载体构建的新方法:重组融合PCR法[J]. 邝翡婷,袁定阳,李莉,李新奇. 基因组学与应用生物学. 2012(06)
[3]中国蜘蛛目研究进展[J]. 万莉,朱明生. 黑龙江科技信息. 2012(10)
[4]脂质体转染巴马猪胎儿成纤维细胞条件的优化[J]. 粟文俊,蒋泓,唐冬生,洪亚辉. 中国农学通报. 2011(07)
[5]一种稳定且高效的磷酸钙293T细胞转染法[J]. 唐蓓. 生物技术. 2011(01)
[6]蜘蛛丝的结构与机械性能研究进展[J]. 蒋平,肖永红,吕太勇,廖信军. 井冈山大学学报(自然科学版). 2010(04)
[7]动物转基因及克隆技术研究[J]. 余华,叶健强,刘丹. 信阳农业高等专科学校学报. 2009(02)
[8]一种载体构建的新方法:一步克隆法[J]. 欧阳平,李玉,严红,马立新. 湖北大学学报(自然科学版). 2007(02)
[9]古老的进化物种 奇异的蜘蛛世界[J]. 胡喜海. 中学生物学. 2007(03)
[10]慢病毒载体介导IκB激酶-α（IKKα）基因RNA干扰转基因小鼠的制备[J]. 杨志峰,王龙,杨生生,匡颖,陈欢,徐国江,蔡在龙,王铸钢,毛积芳. 生物化学与生物物理进展. 2007(02)
硕士论文
[1]脂质体转染制备转基因鹌鹑的研究[D]. 李艳.石河子大学 2013
本文编号：3119454
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