大、小鼠来源日本血吸虫凋亡相关基因的差异表达分析及Sjcaspase3/7的克
发布时间：2021-04-05 06:45
日本血吸虫病是一种危害严重的人畜共患寄生虫病,仍是我国重要的公共卫生问题之一。截止到2013年底,我国仍推算有血吸虫病人18多万例。至今,仍没有理想的血吸虫病疫苗可在现场应用,血吸虫病防治仍主要依靠大规模的吡喹酮化疗,且已有血吸虫对吡喹酮产生抗药性的报道。因此,迫切需要筛选治疗血吸虫病新药物。细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种主要方式,日本血吸虫细胞凋亡的研究可为日本血吸虫新药靶的筛选提供新思路。本研究通过对日本血吸虫全基因组信息挖掘,鉴定了15个日本血吸虫凋亡相关基因。通过RT-PCR技术分析了这些凋亡相关基因在适宜性宿主BALB/c小鼠和非适宜性宿主Wistar大鼠来源的不同时期的日本血吸虫中的转录水平和表达差异,对其中重要的差异表达基因Sjcaspase3/7进行了克隆、真核表达及生物学功能分析,为深入研究日本血吸虫凋亡机制和新药靶的鉴定奠定了基础。1.大、小鼠来源日本血吸虫凋亡相关基因的表达分析分别收集了BALB/c小鼠和Wistar大鼠来源14d,23d,32d,42d四个时期共八组日本血吸虫虫体,利用Trizol提取虫体的总RNA并反转录成cDNA。利用日本血吸虫全基因组本地B...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 引言
1.1 血吸虫与血吸虫病
1.2 血吸虫病需要新的治疗方法
1.3 细胞凋亡
1.3.1 细胞凋亡与细胞坏死
1.3.2 细胞凋亡的典型特征
1.4 细胞凋亡通路
1.4.1 死亡受体通路
1.4.2 线粒体通路
1.4.3 内质网通路
1.5 日本血吸虫细胞凋亡观察
1.5.1 虫体形态结构观察
1.5.2 细胞水平观察
1.5.3 染色体水平观察
1.5.4 基因水平观察
1.6 日本血吸虫重要凋亡基因的研究
1.7 日本血吸虫半胱天冬酶（Caspase）家族相关研究
1.8 日本血吸虫凋亡与药物靶点的研究
1.9 本文总体研究思路
第二章 大、小鼠来源日本血吸虫凋亡相关基因的表达分析
2.1. 引言
2.2. 实验材料
2.2.1 生物材料
2.2.2 主要试剂和酶
2.2.3 主要仪器
2.3. 实验方法
2.3.1 日本血吸虫全基因组本地BLAST数据库建立
2.3.2 日本血吸虫凋亡相关基因搜索
2.3.3 日本血吸虫虫体的收集
2.3.4 各期别日本血吸虫cDNA模板的制备
2.3.5 RT-PCR检测凋亡相关基因的表达量
2.4. 实验结果
2.4.1 日本血吸虫全基因组本地BLAST数据库建立
2.4.2 日本血吸虫凋亡相关基因的搜索
2.4.3 大、小鼠来源不同时期日本血吸虫凋亡相关基因的表达分析
2.5. 讨论
第三章 日本血吸虫凋亡基因Sjcaspase7的克隆、真核表达及生物学功能分析
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1. 生物材料
3.2.2. 主要试剂和酶
3.2.3. 主要仪器
3.3 实验方法
3.3.1. RNA提取与反转录
3.3.2. Sjcaspase7基因的克隆
3.3.3. 构建pXJ40-FLAG-Sjcaspase7真核表达质粒
3.3.4. pXJ40-FLAG-Sjcaspase7质粒转染Hela细胞
3.3.5. 间接免疫荧光检测rSjcaspase7重组蛋白表达
3.3.6. Western Blotting分析重组蛋白rSjcaspase7
3.3.7. 抑制剂对Caspase酶活力抑制作用分析
3.3.8. 流式细胞术检测细胞凋亡
3.3.9. RT-PCR分析Sjcaspase7在各时期虫体中的表达
3.3.10. 体外共转染筛选Sjcaspase7小干扰RNA（SiRNA）
3.3.11. Sjcaspase7基因体内干扰
3.3.12. RT-PCR分析Sjcaspase7表达水平
3.3.13. 虫体Caspase酶活检测
3.4 实验结果
3.4.1. PCR扩增日本血吸虫Sjcaspase7基因
3.4.2. IFA检测rSjcaspase7重组蛋白的表达
3.4.3. Western Blotting分析rSjcaspase7重组蛋白
3.4.4. 抑制剂对Caspase酶活力抑制作用分析
3.4.5. 流式细胞技术检测细胞凋亡
3.4.6. Sjcaspase7在各时期虫体中表达量
3.4.7. 体外筛选Sjcaspase7优选小干扰RNA（ SiRNA ）
3.4.8. RT-PCR分析Sjcaspase7的表达水平
3.4.9. 虫体Caspase酶活力检测
3.4.10.干扰后诱导的减虫和减卵效果
3.5 讨论
第四章 日本血吸虫凋亡基因Sjcaspase3的克隆、真核表达及生物学功能分析
4.1. 引言
4.2. 实验材料
4.2.1. 生物材料
4.2.2. 主要试剂和酶
4.2.3. 主要仪器
4.3. 实验方法
4.3.1. Sjcaspase3基因的克隆
4.3.2. 生物信息学分析
4.3.3. RT-PCR分析Sjcaspase3在各期别虫体中的表达量
4.3.4. pXJ40-FLAG-SjCaspase3重组质粒构建
4.3.5. 转染Hela细胞
4.3.6. RT-PCR分析Sjcaspase3基因在Hela细胞中的表达
4.3.7. Western Blotting分析Sjcaspase3蛋白表达
4.3.8. rSjcaspase3重组蛋白的纯化
4.3.9. Caspase酶活检测
4.3.10. 流式细胞术检测细胞凋亡
4.4. 实验结果
4.4.1. Sjcaspase3基因克隆和生物信息学分析
4.4.2. Sjcaspase3在各期别虫体中的表达
4.4.3. 重组质粒转染后Hela细胞Sjcaspase3基因转录水平分析
4.4.4. Western Blotting检测转染Hela细胞Sjcaspase3蛋白表达情况
4.4.5. rSjcaspase3重组蛋白的纯化
4.4.6. 酶活检测
4.4.7. 流式细胞分析检测细胞凋亡
4.5. 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]2013年全国血吸虫病疫情通报[J]. 雷正龙,郑浩,张利娟,朱蓉,徐志敏,许静,付青,王强,李石柱,周晓农. 中国血吸虫病防治杂志. 2014(06)
[2]带myc标签的人HER2基因真核表达载体的构建及其生物学功能[J]. 宋金洁,王涛,徐小洁,符静,刘家宏,叶棋浓,江泽飞. 细胞与分子免疫学杂志. 2013(06)
[3]甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白真核表达载体的构建与表达[J]. 张文帅,卞倩,迟莹,温恬,李燕,焦永军. 现代预防医学. 2011(16)
[4]Caspase家族与细胞凋亡[J]. 岳原亦,张扬,张一奇. 中国医疗前沿. 2011(06)
[5]我国“十二五”期间血吸虫病防治策略与工作重点[J]. 周晓农,林丹丹,汪天平,陈红根,郭家钢,梁幼生,邱东川,董兴齐,李石柱. 中国血吸虫病防治杂志. 2011(01)
[6]2009年全国血吸虫病疫情通报[J]. 郝阳,郑浩,朱蓉,郭家钢,王立英,陈朝,周晓农. 中国血吸虫病防治杂志. 2010(06)
[7]内质网应激介导的细胞凋亡[J]. 关丽英,许彩民,潘华珍. 生物化学与生物物理进展. 2007(11)
[8]小鼠感染日本血吸虫后肝组织Bcl-2、Bax的表达及己酮可可碱对它的作用[J]. 魏屏,罗端德,熊莉娟,曾令兰. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2005(06)
[9]RNA干扰及其在寄生虫学研究中的应用[J]. 曹建平,成静,刘述先. 国外医学(寄生虫病分册). 2005(04)
[10]Dose-dependent Inhibition of Gynecophoral Canal Protein Gene Expression in Vitro in the Schistosome（Schistosomajaponicum）by RNA Interference[J]. Guo-Feng CHENG~1 Jiao-Jiao LIN~1 Yi SHI~2 You-Xin JIN~2 Zhi-Qiang FU~1 Ya-Mei JIN~1 Yuan-Cong ZHOU~2 You-Min CA~11 Shanghai Institute of Animal Parasitology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Lahoratory of Animal Parasitology,Ministry of Agriculture, Shanghai 200232, China;2 State Key Laboratory, of Molecular Biology Institute of Biochemistry and Cell Biology Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. Shanghai 200031, China. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2005(06)
博士论文
[1]日本血吸虫感染不同适宜性啮齿类动物后宿主及虫体miRNA表达分析[D]. 韩宏晓.扬州大学 2013
[2]不同宿主来源日本血吸虫童虫差异表达基因的研究[D]. 彭金彪.中国农业科学院 2010
硕士论文
[1]日本血吸虫凋亡诱导因子SjAIF的初步研究[D]. 陆看.上海师范大学 2015
[2]日本血吸虫细胞凋亡的初步观察[D]. 郭小勇.中国农业科学院 2014
[3]日本血吸虫基因SjCaspase9的克隆、表达及免疫保护效果的初步评估[D]. 王飞.南京农业大学 2011
[4]Stat3对Snail的调控及在食管鳞癌上皮间质转化中的作用[D]. 贺红柳.郑州大学 2011
本文编号：3119343
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 引言
1.1 血吸虫与血吸虫病
1.2 血吸虫病需要新的治疗方法
1.3 细胞凋亡
1.3.1 细胞凋亡与细胞坏死
1.3.2 细胞凋亡的典型特征
1.4 细胞凋亡通路
1.4.1 死亡受体通路
1.4.2 线粒体通路
1.4.3 内质网通路
1.5 日本血吸虫细胞凋亡观察
1.5.1 虫体形态结构观察
1.5.2 细胞水平观察
1.5.3 染色体水平观察
1.5.4 基因水平观察
1.6 日本血吸虫重要凋亡基因的研究
1.7 日本血吸虫半胱天冬酶（Caspase）家族相关研究
1.8 日本血吸虫凋亡与药物靶点的研究
1.9 本文总体研究思路
第二章 大、小鼠来源日本血吸虫凋亡相关基因的表达分析
2.1. 引言
2.2. 实验材料
2.2.1 生物材料
2.2.2 主要试剂和酶
2.2.3 主要仪器
2.3. 实验方法
2.3.1 日本血吸虫全基因组本地BLAST数据库建立
2.3.2 日本血吸虫凋亡相关基因搜索
2.3.3 日本血吸虫虫体的收集
2.3.4 各期别日本血吸虫cDNA模板的制备
2.3.5 RT-PCR检测凋亡相关基因的表达量
2.4. 实验结果
2.4.1 日本血吸虫全基因组本地BLAST数据库建立
2.4.2 日本血吸虫凋亡相关基因的搜索
2.4.3 大、小鼠来源不同时期日本血吸虫凋亡相关基因的表达分析
2.5. 讨论
第三章 日本血吸虫凋亡基因Sjcaspase7的克隆、真核表达及生物学功能分析
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1. 生物材料
3.2.2. 主要试剂和酶
3.2.3. 主要仪器
3.3 实验方法
3.3.1. RNA提取与反转录
3.3.2. Sjcaspase7基因的克隆
3.3.3. 构建pXJ40-FLAG-Sjcaspase7真核表达质粒
3.3.4. pXJ40-FLAG-Sjcaspase7质粒转染Hela细胞
3.3.5. 间接免疫荧光检测rSjcaspase7重组蛋白表达
3.3.6. Western Blotting分析重组蛋白rSjcaspase7
3.3.7. 抑制剂对Caspase酶活力抑制作用分析
3.3.8. 流式细胞术检测细胞凋亡
3.3.9. RT-PCR分析Sjcaspase7在各时期虫体中的表达
3.3.10. 体外共转染筛选Sjcaspase7小干扰RNA（SiRNA）
3.3.11. Sjcaspase7基因体内干扰
3.3.12. RT-PCR分析Sjcaspase7表达水平
3.3.13. 虫体Caspase酶活检测
3.4 实验结果
3.4.1. PCR扩增日本血吸虫Sjcaspase7基因
3.4.2. IFA检测rSjcaspase7重组蛋白的表达
3.4.3. Western Blotting分析rSjcaspase7重组蛋白
3.4.4. 抑制剂对Caspase酶活力抑制作用分析
3.4.5. 流式细胞技术检测细胞凋亡
3.4.6. Sjcaspase7在各时期虫体中表达量
3.4.7. 体外筛选Sjcaspase7优选小干扰RNA（ SiRNA ）
3.4.8. RT-PCR分析Sjcaspase7的表达水平
3.4.9. 虫体Caspase酶活力检测
3.4.10.干扰后诱导的减虫和减卵效果
3.5 讨论
第四章 日本血吸虫凋亡基因Sjcaspase3的克隆、真核表达及生物学功能分析
4.1. 引言
4.2. 实验材料
4.2.1. 生物材料
4.2.2. 主要试剂和酶
4.2.3. 主要仪器
4.3. 实验方法
4.3.1. Sjcaspase3基因的克隆
4.3.2. 生物信息学分析
4.3.3. RT-PCR分析Sjcaspase3在各期别虫体中的表达量
4.3.4. pXJ40-FLAG-SjCaspase3重组质粒构建
4.3.5. 转染Hela细胞
4.3.6. RT-PCR分析Sjcaspase3基因在Hela细胞中的表达
4.3.7. Western Blotting分析Sjcaspase3蛋白表达
4.3.8. rSjcaspase3重组蛋白的纯化
4.3.9. Caspase酶活检测
4.3.10. 流式细胞术检测细胞凋亡
4.4. 实验结果
4.4.1. Sjcaspase3基因克隆和生物信息学分析
4.4.2. Sjcaspase3在各期别虫体中的表达
4.4.3. 重组质粒转染后Hela细胞Sjcaspase3基因转录水平分析
4.4.4. Western Blotting检测转染Hela细胞Sjcaspase3蛋白表达情况
4.4.5. rSjcaspase3重组蛋白的纯化
4.4.6. 酶活检测
4.4.7. 流式细胞分析检测细胞凋亡
4.5. 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]2013年全国血吸虫病疫情通报[J]. 雷正龙,郑浩,张利娟,朱蓉,徐志敏,许静,付青,王强,李石柱,周晓农. 中国血吸虫病防治杂志. 2014(06)
[2]带myc标签的人HER2基因真核表达载体的构建及其生物学功能[J]. 宋金洁,王涛,徐小洁,符静,刘家宏,叶棋浓,江泽飞. 细胞与分子免疫学杂志. 2013(06)
[3]甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白真核表达载体的构建与表达[J]. 张文帅,卞倩,迟莹,温恬,李燕,焦永军. 现代预防医学. 2011(16)
[4]Caspase家族与细胞凋亡[J]. 岳原亦,张扬,张一奇. 中国医疗前沿. 2011(06)
[5]我国“十二五”期间血吸虫病防治策略与工作重点[J]. 周晓农,林丹丹,汪天平,陈红根,郭家钢,梁幼生,邱东川,董兴齐,李石柱. 中国血吸虫病防治杂志. 2011(01)
[6]2009年全国血吸虫病疫情通报[J]. 郝阳,郑浩,朱蓉,郭家钢,王立英,陈朝,周晓农. 中国血吸虫病防治杂志. 2010(06)
[7]内质网应激介导的细胞凋亡[J]. 关丽英,许彩民,潘华珍. 生物化学与生物物理进展. 2007(11)
[8]小鼠感染日本血吸虫后肝组织Bcl-2、Bax的表达及己酮可可碱对它的作用[J]. 魏屏,罗端德,熊莉娟,曾令兰. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2005(06)
[9]RNA干扰及其在寄生虫学研究中的应用[J]. 曹建平,成静,刘述先. 国外医学(寄生虫病分册). 2005(04)
[10]Dose-dependent Inhibition of Gynecophoral Canal Protein Gene Expression in Vitro in the Schistosome（Schistosomajaponicum）by RNA Interference[J]. Guo-Feng CHENG~1 Jiao-Jiao LIN~1 Yi SHI~2 You-Xin JIN~2 Zhi-Qiang FU~1 Ya-Mei JIN~1 Yuan-Cong ZHOU~2 You-Min CA~11 Shanghai Institute of Animal Parasitology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Lahoratory of Animal Parasitology,Ministry of Agriculture, Shanghai 200232, China;2 State Key Laboratory, of Molecular Biology Institute of Biochemistry and Cell Biology Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. Shanghai 200031, China. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2005(06)
博士论文
[1]日本血吸虫感染不同适宜性啮齿类动物后宿主及虫体miRNA表达分析[D]. 韩宏晓.扬州大学 2013
[2]不同宿主来源日本血吸虫童虫差异表达基因的研究[D]. 彭金彪.中国农业科学院 2010
硕士论文
[1]日本血吸虫凋亡诱导因子SjAIF的初步研究[D]. 陆看.上海师范大学 2015
[2]日本血吸虫细胞凋亡的初步观察[D]. 郭小勇.中国农业科学院 2014
[3]日本血吸虫基因SjCaspase9的克隆、表达及免疫保护效果的初步评估[D]. 王飞.南京农业大学 2011
[4]Stat3对Snail的调控及在食管鳞癌上皮间质转化中的作用[D]. 贺红柳.郑州大学 2011
本文编号：3119343
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