猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR方法和间接ELISA方法的建立与初步应用

发布时间：2021-04-09 22:42

　　猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻和食欲下降为基本特征，各种年龄阶段的猪可能感染，但仔猪最易感。该病最初发现时发病率高，死亡率较低，但是近年来PEDV引起山东的仔猪腹泻爆发，病死率达100%。为了有效防治该病，本研究建立了检测PEDV的荧光定量PCR诊断方法和检测PEDV抗体的间接ELISA检测方法。本研究共分为三个部分：1PEDV荧光定量PCR的建立根据PEDV的M基因序列，本研究合成了针对该序列的Taqman探针和引物，建立了检测PEDV的绝对荧光定量PCR方法，绘制了标准曲线方程为Y=-2.146X+22.769，各个参数为Slope=-2.146，扩增效率：E=10-1/斜率-1=10-1/-2.146-1=192.433%，相关系数：R2=0.994。试验证明该方法特异性强、重复性好、灵敏度高、最低可检测到10copies/μL。应用建立的荧光定量PCR对来自山东省的40份临床呈腹泻症状的病料进行了检测，检测出30份PEDV阳性，检出率为75%，说明PEDV引起山东省大部分猪场的仔猪腹泻的原因之一。2PEDV... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

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符号说明
中文摘要
ABSTRACT
1 引言
    1.1 PEDV 的形态学
        1.1.1 PEDV 的生物学特性
    1.2 PEDV 的分子生物学研究
        1.2.1 基因组结构特点
        1.2.2 结构蛋白
        1.2.3 非结构蛋白
        1.2.4 N 蛋白的特点
    1.3 PEDV 的基因分型和流行特点
    1.4 猪流行性腹泻病毒的流行病学
    1.5 猪流行性腹泻病毒的临床症状和病理变化
        1.5.1 临床症状
        1.5.2 病理变化
    1.6 猪流行性腹泻病毒致病机理
    1.7 猪流行性腹泻病毒的增殖培养
    1.8 猪流行性腹泻病毒的诊断方法
        1.8.1 根据临床症状和病理剖检变化初步诊断
        1.8.2 人工感染试验
        1.8.3 免疫电镜法（IEM）
        1.8.4 原位杂交技术（ISH）
        1.8.5 免疫荧光法
        1.8.6 血清中和试验
        1.8.7 胶体金抗体检测技术
        1.8.8 RT-PCR 法
        1.8.9 反转录环介导等温 PCR 法
        1.8.10 荧光定量 PCR 法
        1.8.11 ELISA 法
    1.9 PEDV 的疫苗预防和治疗
        1.9.1 疫苗预防
        1.9.2 治疗
    1.10 本研究的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 毒株和病料
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 试验中配制的试剂
    2.2 方法
        2.2.1 PEDV 荧光定量 PCR 方法的建立的材料与方法
        2.2.2 PEDV 的 N 蛋白基因原核表达的材料与方法
        2.2.3 PEDV N 蛋白间接 ELISA 方法建立和初步应用的材料与方法
3 结果与分析
    3.1 PEDV 荧光定量 PCR 方法的建立的结果
        3.1.1 荧光引物的 PCR 检测
        3.1.2 标准品的制备
        3.1.3 PCR 反应条件的优化
        3.1.4 标准曲线的绘制
        3.1.5 灵敏性试验
        3.1.6 特异性试验
        3.1.7 重复性试验
        3.1.8 临床病料的检测结果
    3.2 PEDV 的 N 蛋白基因原核表达的结果
        3.2.1 PEDV N 基因 PCR 扩增
        3.2.2 重组质粒 pET30a-PEDVN 的鉴定
        3.2.3 重组质粒的初步表达
        3.2.4 诱导表达条件的优化
        3.2.5 蛋白的纯化
        3.2.6 Western-blot 验证表达蛋白
    3.3 PEDV N 蛋白间接 ELISA 方法建立和初步应用的结果
        3.3.1 间接 ELISA 方法的优化
        3.3.2 临床血清的检测
4 讨论
    4.1 荧光定量 PCR 方法的建立和应用
    4.2 PEDV N 蛋白的原核表达和条件优化的研究
    4.3 PEDV N 蛋白间接 ELISA 的研究
5 结论
参考文献
致谢
硕士期间发表文章


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻胶体金抗体检测技术的建立及其应用[J]. 张利勃,周铁忠,王珅,高慎阳.  中国农学通报. 2011(03)
[2]表达猪流行性腹泻病毒中和抗原位点的重组干酪乳杆菌免疫小鼠诱导的免疫应答[J]. 葛俊伟,姜艳平,汪淼,乔薪瑗,刘敏,唐丽杰,李一经.  中国兽医科学. 2010(07)
[3]表面表达猪流行性腹泻病毒核蛋白蛋白的重组干酪乳杆菌诱导产生的免疫应答[J]. 葛俊伟,姜艳平,汪淼,乔薪瑗,刘敏,唐丽杰,李一经.  生物工程学报. 2009(06)
[4]猪流行性腹泻病毒M基因及其片段原核表达效果分析[J]. 高慎阳,邹运明,李一经.  中国预防兽医学报. 2007(01)
[5]猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白抗原间接ELISA抗体检测方法的建立[J]. 孙东波,冯力,时洪艳,刘胜旺,陈洪岩,佟有恩,李伟杰,王明,马思奇,陈建飞.  中国预防兽医学报. 2006(05)
[6]猪传染性胃肠炎病毒TH-98株S基因核酸疫苗的构建及其免疫效力[J]. 任晓峰,尹杰超,司微,李一经,刘宝全.  中国兽医科学. 2006(03)
[7]流行性腹泻病毒E基因与pSFV重组RNA的构建[J]. 余丽芸,侯喜林.  黑龙江八一农垦大学学报. 2005(01)
[8]猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻二联弱毒疫苗的研究[J]. 佟有恩,冯力,李伟杰,朱远茂,王明,马思奇.  中国预防兽医学报. 1999(06)
[9]猪流行性腹泻的免疫研究[J]. 钱永清,闻人楚,唐永兰,陈培龙,苏万国,许大新,张国强.  上海畜牧兽医通讯. 1999(03)
[10]猪流行性腹泻弱毒株的培育[J]. 佟有恩,冯力,李伟杰,王明,马思奇.  中国畜禽传染病. 1998(06)

硕士论文
[1]猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻快速诊断方法的建立及S基因的表达[D]. 刘邓.新疆农业大学 2009



本文编号：3128435