猪圆环病毒2型复制子的构建及鉴定

发布时间：2021-04-14 12:32

　　猪圆环病毒（Porcine Circovirus, PCV）为圆环病毒科,圆环病毒属成员。根据致病性、抗原性及核苷酸序列不同可将猪圆环病毒分为两个型：猪圆环病毒1型（PCV1）与猪圆环病毒2型（PCV2）。一般认为PCV1没有致病性,而PCV2则可以引起断奶仔猪多系统衰竭症（PMWS）、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎,猪皮炎和肾病综合征（PDNS）以及猪的先天性震颤（CT）等疾病。该病毒在全球各地广泛流行,给世界养猪业带来了巨大的经济损失。目前,猪圆环病毒病（PCVD）尚无有效的治疗方法,主要是以疫苗预防为主。由于PCV2在细胞上增殖滴度低、体外培养困难,而且病毒复制机理尚不清楚,这给PCVD的防治带来了很大的障碍。本研究共构建了四个含有EGFP或Rluc报告基因的PCV2复制子及三个非复制子对照。经实验验证,本研究构建的基于Rluc报告基因的PCV2复制子具有较好的活性。该复制子既可为体外进一步研究PCV复制机制奠定基础,又可为抗病毒先导化合物的筛选提供新方法。本研究的主要内容和结果如下：（1）基于EGFP、Rluc报告基因标记的PCV2复制子的构建通过PCR方法,从含有PCV2... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
縮略语表
1. 文献综述
    1.1 猪圆环病毒概述
    1.2 猪圆环病毒的理化特性
    1.3 猪圆环病毒的基因组特点
    1.4 猪圆环病毒基因组的转录
    1.5 猪圆环病毒的主要功能蛋白
        1.5.1 Rep蛋白
        1.5.2 Cap蛋白
        1.5.3 其他蛋白
    1.6 猪圆环病毒的复制机理研究进展
    1.7 病毒与宿主的相互作用
2. 目的意义
3. 材料与方法
    3.1 实验材料
        3.1.1 质粒、菌株和细胞
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要试剂及溶液的配制
            3.1.3.1 抗生素类
            3.1.3.2 培养基
            3.1.3.3 其它溶液
        3.1.4 引物
    3.2 实验方法
        3.2.1 PCR扩增目的片段
        3.2.2 目的DNA片段的纯化回收
        3.2.3 目的片段的连接
        3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
        3.2.5 连接产物的转化
        3.2.6 质粒的少量提取与酶切鉴定
            3.2.6.1 质粒的少量提取
            3.2.6.2 质粒的酶切鉴定
        3.2.7 质粒的大量制备
        3.2.8 细胞的复苏、传代、冻存
            3.2.8.1 细胞的复苏
            3.2.8.2 细胞的传代
            3.2.8.3 细胞的冻存
        3.2.9 细胞转染
        3.2.10 EGFP蛋白的定量检测
        3.2.11 海肾荧光素酶活性检测
        3.2.12 细胞总DNA的提取
        3.2.13 荧光定量PCR
4. 结果与分析
    4.1 基于EGFP报告基因的PCV2复制子的构建及验证
        4.1.1 复制子质粒的构建
            4.1.1.1 PCV2 ORF1基因的扩增
            4.1.1.2 pIRES2-ORF1-EGFP质粒的构建
            4.1.1.3 复制子pT-Ori-ORF1-IRES-EGFP和非复制子pT-ORF1-IRES-EGFP的构建
        4.1.2 复制子活性的初步检测
            4.1.2.1 荧光强度与转染EGFP细胞蛋白的相关性分析
            4.1.2.2 转染复制子与非复制子后荧光强度的比较
    4.2 基于Rluc报告基因的PCV2复制子的构建及验证
        4.2.1 质粒的构建
            4.2.1.1 PCV2 ORF1的克隆
            4.2.1.2 Rluc基因的克隆
            4.2.1.3 质粒pc-Rluc的构建
            4.2.1.4 质粒pc-Rluc-2A-ORF1的构建
            4.2.1.5 复制子pT-Ori-Rluc-2A-ORF1和非复制子pT-Rluc-2A-ORF1的构建
        4.2.2 复制子活性的初步检测
    4.3 PCV2复制子的优化
        4.3.1 PCV2复制起始区Ori的扩增
        4.3.2 复制子质粒pc-Ori-Rluc-2A-ORF1和pc-Rluc-2A-ORF1-Ori的构建
            4.3.2.1 复制子质粒pc-Ori-Rluc-2A-ORF1的构建
            4.3.2.2 复制子质粒pc-Rluc-2A-ORF1-Ori的构建
    4.4 PCV2复制子活性检测条件的优化
        4.4.1 最佳检测时间的确定
        4.4.2 最佳转染剂量的确定
    4.5 利巴韦林对PCV2复制子活性的影响
        4.5.1 利巴韦林对复制子蛋白表达的影响
        4.5.2 利巴韦林对复制子拷贝数的影响
5. 讨论与结论
    5.1 讨论
        5.1.1 复制子系统
        5.1.2 报告基因
        5.1.3 PCV2复制子的构建及优化
        5.1.4 复制子活性检测条件的优化
        5.1.5 利巴韦林对PCV2复制子活性的影响
            5.1.5.1 利巴韦林对复制子蛋白表达的影响
            5.1.5.2 利巴韦林对复制子拷贝数的影响
    5.2 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
[1]猪圆环病毒2型的分子流行病学分析及病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达[D]. 李玲.中国农业科学院 2012



本文编号：3137324