羊源尸毒梭菌三重PCR检测方法的建立及应用

发布时间：2021-04-15 16:09

　　为建立一种快速检测羊源尸毒梭菌的方法,本研究参考尸毒梭菌23S rRNA基因、高致病性毒力岛irp2基因和溶血素hlyA基因的特异序列,设计合成3对特异性引物,通过优化条件建立了检测羊源尸毒梭菌的三重PCR方法,并评估了其特异性、敏感性和重复性。将尸毒梭菌人工感染小鼠,利用建立的三重PCR方法检测死亡小鼠各组织中的尸毒梭菌,并与16S rDNA PCR方法的检测结果相比较。结果显示,该三重PCR方法优化后的条件为:3对基因上、下游引物均为1μL终浓度均为10μmol/L,退火温度59℃。该方法仅对尸毒梭菌扩增出23S rRNA、irp2和hlyA 3个目的基因,而对蜡样芽孢杆菌、类志贺邻单胞菌、乳酸片球菌、藤黄微球菌、霍氏肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、柠檬酸杆菌及枯草芽孢杆菌均未扩增出目的基因;对尸毒梭菌DNA的最低检出量为2.76×101拷贝/μL,敏感性较高;该方法对同一稀释度及不同稀释度尸毒梭菌DNA的重复性检测结果均一致,重复性较好。人工感染1.5×109cfu/mL的尸毒梭菌的小鼠12 h全部死亡,对照组小鼠未出现发病和死亡,且经本研究建立的三重PCR方法检测结果显示,每只死... 

【文章来源】：中国预防兽医学报. 2020,42(11)北大核心CSCD

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

三重PCR方法退火温度的优化结果

经测定尸毒梭菌DNA浓度为77.20 ng/μL，经计算为2.76×1010拷贝/μL。将其10被倍比稀释后（2.76×1010拷贝/μL～2.76×100拷贝/μL）作为模板，经该三重PCR方法扩增。结果显示，该方法对该菌DNA的最低检出量为2.76×101拷贝/μL（图3）。表明，该方法的敏感性较高。图3 三重PCR的敏感性检测结果

三重PCR的敏感性检测结果

【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
[1]大肠杆菌O157:H7和单增李斯特菌主要毒力因子多重荧光定量PCR检测方法的建立和应用[D]. 夏灿.南京农业大学 2016
[2]腹泻仔猪源E.coli的分离及毒力因子分子流行情况调查[D]. 杨宇.湖南农业大学 2015
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本文编号：3139658