新吉细毛羊皮肤组织均一全长cDNA文库的ESTs生物信息学分析
发布时间：2021-04-16 16:27
本文通过EST生物信息学的应用，对已构建的新吉细毛羊cDNA文库进行活化，期望能够挖掘影响新吉细毛羊相关毛用性状的基因亦或可能选出起主导作用的主效基因。运用菌落PCR、菌液PCR、质粒快速鉴定等三种方法对cDNA文库进行评价，通过测序，在NCBI上BLASTn搜索、比对及运用DNAstar等软件进行分析。初步鉴定的结果：cDNA文库的库容量（滴度）为1.57×106pfu·ml-1，菌落PCR、菌液PCR阳性克隆的小片段率在80%-90%，克隆的片段大小在0.6kb-2.0kb，cDNA在300bp-500bp，而质粒快速鉴定的在90%，克隆的片段大小载体带3.5kb-5.0kb。质粒快速鉴定的效果稍好于其它两种方法，耗时相对短，同时小片段率稍高一些；cDNA文库保存完好，符合基因文库的质量要求，有足够大的库容量来保证筛选目的基因。通过对筛选的阳性克隆5’端随机测序，随后获得可读序列474条，经过相关生物信息学分析之后，发现其中可能含有完整基因，为进一步发现毛性状相关新基因奠定基础。利用DNAstar软件的SeqMan程序对获得了474条可读EST序列首先进行初步筛选和分析，进行前处理...
【文章来源】：新疆农业大学新疆维吾尔自治区
【文章页数】：47 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
来自NCBI网站上的统计信息[2]
2图 1-2 来自 NCBI 网站上的部分统计信息[2]Figure 1-2 From the NCBI website statistics一个 EST 是一个 cDNA 克隆的一部分序列，所有的 cDNA 克隆测序，因而产生的 EST 数据都来源于特定的 RNA 源，常见的如动物的肌肉组织或者皮肤组织等。RNA 被转换成更稳定的 cDNA 分子，许多 cDNA 分子组成一个 cDNA 文库。EST序列通常是随机从 cDNA 克隆中选出，然后对一条链进行快速地测序。EST 的长度通常是 300~800bp。在最早的 EST 测序工作中，Adams 等共发现了几百个在当时还未知的基因[3]。EST 序列的长度直接决定了 cDNA 和 mRNA 的信息含量。GenBank 所接受的EST 序列最短要在 100 bp 以上，因为有研究认为 EST 序列的长度在 150 bp 以上时信息含量最高[3]。EST 序列自身有的优势是由于在 GenBank 中大量的数据库做后盾，
图 2-2 蓝白斑筛选结果注：右侧为左侧图中局部放大显示，黄色三角标示的是白斑，蓝色方框标示的是蓝斑Figure 2-2 The result of white-blue plaque selectionNote: Partial zoom in right to left, yellow triangle marked white spots, blue box marked blue spotcDNA 文库的库容量作为文库质量评定的主要参数之一，依据公式计算得 1.57×106pfu·mL-1，一般要求文库的容量应不小于 1.7×105pfu·mL-1，因此，从库容量来讲该文库符合要求，还未见明显退化现象。白斑不一定就是阳性重组子，因为试验中将生色底物 x-gal 涂于固体培养基表面，并不能保证每个区域都涂上 x-gal，没有生色底物的地方不管是阳性还是阴性菌落都不会显蓝色，所以有一小部分的白色菌落可能是假阳性需要进一步验证。2.2.1.2 三种筛选方法鉴定插入片段的大小及小片段率
【参考文献】：
期刊论文
[1]Lef-1基因在棕色和白色羊驼皮肤差异表达[J]. 杨磊,王海东,王祎,于秀菊,董彦君,董常生. 中国生物化学与分子生物学报. 2011(11)
[2]内蒙古白绒山羊VEGF164基因毛囊特异性表达载体的构建及胎儿成纤维细胞的稳定转染[J]. 鲍文蕾,李彬,侯鑫,刘俊娥,郭旭东,王志钢,刘东军. 中国农业科学. 2011(22)
[3]绵羊MHC区段3个预测基因的验证与表达分析[J]. 焦莎莎,刘卡,李刚,高剑峰,马润林. 遗传. 2011(12)
[4]绵羊FGF5基因的克隆、表达及RNA干扰[J]. 刘伍限,贾斌,石国庆,任建功,刘卡,马润林. 遗传. 2011(09)
[5]不同被毛密度獭兔的皮肤组织差异表达基因研究[J]. 陈赛娟,谷子林,董兵,刘亚娟,刘涛. 畜牧兽医学报. 2011(06)
[6]绵羊皮肤源EST-SSR标记的功能注释及染色体电子定位[J]. 王遵宝,赵宗胜,余鹏,吴洪宾,班谦,梁耀伟,郑炜. 遗传. 2011(07)
[7]PolⅡ型启动子K14实现组织特异RNAi[J]. 代蓉,沈思军,万鹏程,石国庆,孟庆勇,刘守仁. 遗传. 2011(07)
[8]中国美利奴绵羊55L9 BAC克隆基因的筛选与序列的初步分析[J]. 董慧芹,李峰,白大章,杨晓亮,陈芳,高剑峰. 江苏农业学报. 2011(02)
[9]绵羊Klf4编码区的克隆、序列分析与原核表达[J]. 杨越飞,王春生,李昊,罗芳,渠俊杰,朴善花,安铁洙. 中国兽医学报. 2011(04)
[10]应用mRNA差异显示技术筛选绵羊皮肤毛囊差异表达序列标签[J]. 杨华,杨永林,王宁,李辉,沈敏. 中国草食动物. 2011(02)
博士论文
[1]油桐种子EST文库构建及FAD2等重要基因全长cDNA克隆[D]. 谢禄山.中南林业科技大学 2011
[2]Hoxc13基因在绒山羊皮肤中的表达规律及体外功能分析[D]. 吴江鸿.内蒙古农业大学 2011
[3]内蒙古绒山羊毛囊发育、生长周期及相关基因的研究[D]. 尹俊.内蒙古大学 2004
硕士论文
[1]绿盲蝽气味降解酶相关基因的鉴定及功能初步研究[D]. 沈忱.山西师范大学 2012
[2]辽宁新品系绒山羊角蛋白家族四个基因在皮肤中的表达及分析[D]. 邢孟欣.辽宁师范大学 2010
[3]草鱼肝肾cDNA文库构建及部分功能基因的序列分析[D]. 王丽坤.南昌大学 2008
[4]草鱼肠道组织cDNA文库构建及部分ESTs分析[D]. 张学俊.四川大学 2007
[5]新疆荒漠昆虫光滑鳖甲（Anatolica Polita borealis）cDNA文库的构建及相关功能基因筛选[D]. 杨长庚.新疆大学 2006
本文编号：3141772
【文章来源】：新疆农业大学新疆维吾尔自治区
【文章页数】：47 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
来自NCBI网站上的统计信息[2]
2图 1-2 来自 NCBI 网站上的部分统计信息[2]Figure 1-2 From the NCBI website statistics一个 EST 是一个 cDNA 克隆的一部分序列，所有的 cDNA 克隆测序，因而产生的 EST 数据都来源于特定的 RNA 源，常见的如动物的肌肉组织或者皮肤组织等。RNA 被转换成更稳定的 cDNA 分子，许多 cDNA 分子组成一个 cDNA 文库。EST序列通常是随机从 cDNA 克隆中选出，然后对一条链进行快速地测序。EST 的长度通常是 300~800bp。在最早的 EST 测序工作中，Adams 等共发现了几百个在当时还未知的基因[3]。EST 序列的长度直接决定了 cDNA 和 mRNA 的信息含量。GenBank 所接受的EST 序列最短要在 100 bp 以上，因为有研究认为 EST 序列的长度在 150 bp 以上时信息含量最高[3]。EST 序列自身有的优势是由于在 GenBank 中大量的数据库做后盾，
图 2-2 蓝白斑筛选结果注：右侧为左侧图中局部放大显示，黄色三角标示的是白斑，蓝色方框标示的是蓝斑Figure 2-2 The result of white-blue plaque selectionNote: Partial zoom in right to left, yellow triangle marked white spots, blue box marked blue spotcDNA 文库的库容量作为文库质量评定的主要参数之一，依据公式计算得 1.57×106pfu·mL-1，一般要求文库的容量应不小于 1.7×105pfu·mL-1，因此，从库容量来讲该文库符合要求，还未见明显退化现象。白斑不一定就是阳性重组子，因为试验中将生色底物 x-gal 涂于固体培养基表面，并不能保证每个区域都涂上 x-gal，没有生色底物的地方不管是阳性还是阴性菌落都不会显蓝色，所以有一小部分的白色菌落可能是假阳性需要进一步验证。2.2.1.2 三种筛选方法鉴定插入片段的大小及小片段率
【参考文献】：
期刊论文
[1]Lef-1基因在棕色和白色羊驼皮肤差异表达[J]. 杨磊,王海东,王祎,于秀菊,董彦君,董常生. 中国生物化学与分子生物学报. 2011(11)
[2]内蒙古白绒山羊VEGF164基因毛囊特异性表达载体的构建及胎儿成纤维细胞的稳定转染[J]. 鲍文蕾,李彬,侯鑫,刘俊娥,郭旭东,王志钢,刘东军. 中国农业科学. 2011(22)
[3]绵羊MHC区段3个预测基因的验证与表达分析[J]. 焦莎莎,刘卡,李刚,高剑峰,马润林. 遗传. 2011(12)
[4]绵羊FGF5基因的克隆、表达及RNA干扰[J]. 刘伍限,贾斌,石国庆,任建功,刘卡,马润林. 遗传. 2011(09)
[5]不同被毛密度獭兔的皮肤组织差异表达基因研究[J]. 陈赛娟,谷子林,董兵,刘亚娟,刘涛. 畜牧兽医学报. 2011(06)
[6]绵羊皮肤源EST-SSR标记的功能注释及染色体电子定位[J]. 王遵宝,赵宗胜,余鹏,吴洪宾,班谦,梁耀伟,郑炜. 遗传. 2011(07)
[7]PolⅡ型启动子K14实现组织特异RNAi[J]. 代蓉,沈思军,万鹏程,石国庆,孟庆勇,刘守仁. 遗传. 2011(07)
[8]中国美利奴绵羊55L9 BAC克隆基因的筛选与序列的初步分析[J]. 董慧芹,李峰,白大章,杨晓亮,陈芳,高剑峰. 江苏农业学报. 2011(02)
[9]绵羊Klf4编码区的克隆、序列分析与原核表达[J]. 杨越飞,王春生,李昊,罗芳,渠俊杰,朴善花,安铁洙. 中国兽医学报. 2011(04)
[10]应用mRNA差异显示技术筛选绵羊皮肤毛囊差异表达序列标签[J]. 杨华,杨永林,王宁,李辉,沈敏. 中国草食动物. 2011(02)
博士论文
[1]油桐种子EST文库构建及FAD2等重要基因全长cDNA克隆[D]. 谢禄山.中南林业科技大学 2011
[2]Hoxc13基因在绒山羊皮肤中的表达规律及体外功能分析[D]. 吴江鸿.内蒙古农业大学 2011
[3]内蒙古绒山羊毛囊发育、生长周期及相关基因的研究[D]. 尹俊.内蒙古大学 2004
硕士论文
[1]绿盲蝽气味降解酶相关基因的鉴定及功能初步研究[D]. 沈忱.山西师范大学 2012
[2]辽宁新品系绒山羊角蛋白家族四个基因在皮肤中的表达及分析[D]. 邢孟欣.辽宁师范大学 2010
[3]草鱼肝肾cDNA文库构建及部分功能基因的序列分析[D]. 王丽坤.南昌大学 2008
[4]草鱼肠道组织cDNA文库构建及部分ESTs分析[D]. 张学俊.四川大学 2007
[5]新疆荒漠昆虫光滑鳖甲（Anatolica Polita borealis）cDNA文库的构建及相关功能基因筛选[D]. 杨长庚.新疆大学 2006
本文编号：3141772
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