猪圆环病毒2型Rep蛋白的ATP酶和解旋酶活性的研究
发布时间：2021-04-17 14:52
猪圆环病毒（Porcine Circovirus, PCV）属于圆环病毒科圆环病毒属成员,是迄今发现最小的哺乳动物病毒之一。其基因组为单链环状DNA,大小约为1.76kb,含有两个主要的编码框。主要分为两种型：猪圆环病毒1型（PCV1）和猪圆环病毒2型（PCV2）. PCV1被认为没有致病性,而PCV2被证实是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的病原,同时也可引起猪皮炎与肾病综合征、母猪繁殖障碍、仔猪先天性震颤、增生性坏死性肠炎。猪圆环病毒已在全球各地流行,给养猪业造成严重危害。目前,对于猪圆环病毒引起的相关疾病还没有有效治疗方法,只能采取疫苗接种进行预防,且效果不够理想。只有通过对该病毒的复制机理及蛋白功能进行更加深入的研究,才能找到更好的防治手段。Rep蛋白是一种多功能蛋白,在PCV2病毒复制的多个过程中都起着至关重要的作用。通过同源比对发现Rep蛋白的C端存在解旋酶功能域,而目前为止,对于Rep蛋白的解旋活性的研究还没有开展。本研究对PCV2的Rep蛋白解旋相关功能开展研究,为猪圆环病毒2型蛋白功能、复制及致病机理的研究提供参考。具体工作如下：1.Rep蛋白表达质粒的构建及蛋白的表达纯...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
目录
摘要
Abstract
缩略语表
一. 文献综述
1.1 猪圆环病毒概述
1.2 PCV的病原学特征
1.3 PCV的基因组结构
1.4 PCV基因组的转录
1.5 基因组编码的主要功能蛋白
1.5.1 Cap蛋白
1.5.2 Rep蛋白
1.6 Rep蛋白的结构研究进展
1.7 Rep和Rep'参与的病毒复制过程
1.8 Rep与宿主蛋白的相互作用
1.9 其他病毒Rep蛋白研究进展
1.9.1 双粒病毒Rep蛋白研究进展
1.9.2 腺相关病毒Rep蛋白研究进展
二. 研究目的与意义
三. 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 质粒、菌株
3.1.2 主要试剂
3.1.3 引物设计
3.1.4 荧光底物
3.1.5 主要培养基及相关溶液
3.1.6 缓冲液
3.2 实验方法
3.2.1 目的基因的扩增
3.2.2 表达质粒的构建与鉴定
3.2.3 重组菌的表达与鉴定
3.2.4 Rep蛋白的ATPase活性测定
3.2.5 SUMO-Rep蛋白非特异性ssDNA及dsDNA结合活性的检测
3.2.6 SUMO-Rep蛋白的解旋活性测定
3.2.7 SUMO-Rep蛋白K180A突变体的活性研究
四. 实验结果与分析
4.1 PCV2rep基因的扩增
4.2 重组原核表达载体pET-28a SUMO-rep的酶切鉴定
4.3 Rep蛋白原核表达以及纯化条件的摸索
4.4 Western-blot
4.5 对照蛋白SUMO的表达纯化
4.6 SUMO-REP蛋白ATPase活性研究
4.6.1 SUMO-Rep蛋白浓度对ATP水解反应的影响
4.6.2 ATP水解反应与时间的关系
4.6.3 二价金属离子对SUMO-Rep ATPase活性的影响
4.6.4 核酸对SUMO-Rep ATPase活性的影响
4.7 SUMO-Rep蛋白的核酸结合活性研究
4.7.1 SUMO-Rep与ssDNA结合活性的检测
4.7.2 SUMO-Rep与3’突出dsDNA及5’突出dsDNA结合活性的检测
4.8 SUMO-REP蛋白解旋酶活性研究
4.8.1 SUMO-Rep解旋方向的判定
4.8.2 解旋反应时间曲线
4.8.3 蛋白浓度及底物浓度对解旋速率的影响
4.8.4 二价金属离子对SUMO-Rep解旋反应的影响
4.8.5 ATP对解旋反应的影响
4.8.6 温度对解旋活性的影响
4.8.7 捕获链对解旋反应的影响
4.8.8 解旋酶Km及Vmax的测定
4.9 SUMO-Rep ATPase关键活性位点研究
4.9.1 突变基因的扩增
4.9.2 突变蛋白SUMO-Rep K180A的表达与纯化
4.9.3 SUMO-RepK180A突变蛋白ATPase活性的检测
4.9.4 SUMO-RepK180A突变蛋白解旋解旋活性的检测
五. 讨论与结论
5.1 讨论
5.2 结论
参考文献
致谢
本文编号：3143646
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
目录
摘要
Abstract
缩略语表
一. 文献综述
1.1 猪圆环病毒概述
1.2 PCV的病原学特征
1.3 PCV的基因组结构
1.4 PCV基因组的转录
1.5 基因组编码的主要功能蛋白
1.5.1 Cap蛋白
1.5.2 Rep蛋白
1.6 Rep蛋白的结构研究进展
1.7 Rep和Rep'参与的病毒复制过程
1.8 Rep与宿主蛋白的相互作用
1.9 其他病毒Rep蛋白研究进展
1.9.1 双粒病毒Rep蛋白研究进展
1.9.2 腺相关病毒Rep蛋白研究进展
二. 研究目的与意义
三. 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 质粒、菌株
3.1.2 主要试剂
3.1.3 引物设计
3.1.4 荧光底物
3.1.5 主要培养基及相关溶液
3.1.6 缓冲液
3.2 实验方法
3.2.1 目的基因的扩增
3.2.2 表达质粒的构建与鉴定
3.2.3 重组菌的表达与鉴定
3.2.4 Rep蛋白的ATPase活性测定
3.2.5 SUMO-Rep蛋白非特异性ssDNA及dsDNA结合活性的检测
3.2.6 SUMO-Rep蛋白的解旋活性测定
3.2.7 SUMO-Rep蛋白K180A突变体的活性研究
四. 实验结果与分析
4.1 PCV2rep基因的扩增
4.2 重组原核表达载体pET-28a SUMO-rep的酶切鉴定
4.3 Rep蛋白原核表达以及纯化条件的摸索
4.4 Western-blot
4.5 对照蛋白SUMO的表达纯化
4.6 SUMO-REP蛋白ATPase活性研究
4.6.1 SUMO-Rep蛋白浓度对ATP水解反应的影响
4.6.2 ATP水解反应与时间的关系
4.6.3 二价金属离子对SUMO-Rep ATPase活性的影响
4.6.4 核酸对SUMO-Rep ATPase活性的影响
4.7 SUMO-Rep蛋白的核酸结合活性研究
4.7.1 SUMO-Rep与ssDNA结合活性的检测
4.7.2 SUMO-Rep与3’突出dsDNA及5’突出dsDNA结合活性的检测
4.8 SUMO-REP蛋白解旋酶活性研究
4.8.1 SUMO-Rep解旋方向的判定
4.8.2 解旋反应时间曲线
4.8.3 蛋白浓度及底物浓度对解旋速率的影响
4.8.4 二价金属离子对SUMO-Rep解旋反应的影响
4.8.5 ATP对解旋反应的影响
4.8.6 温度对解旋活性的影响
4.8.7 捕获链对解旋反应的影响
4.8.8 解旋酶Km及Vmax的测定
4.9 SUMO-Rep ATPase关键活性位点研究
4.9.1 突变基因的扩增
4.9.2 突变蛋白SUMO-Rep K180A的表达与纯化
4.9.3 SUMO-RepK180A突变蛋白ATPase活性的检测
4.9.4 SUMO-RepK180A突变蛋白解旋解旋活性的检测
五. 讨论与结论
5.1 讨论
5.2 结论
参考文献
致谢
本文编号：3143646
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3143646.html
