牛分枝杆菌Mb1514基因的原核表达及功能分析

发布时间：2021-04-20 18:06

　　牛结核病（Bovine tuberculosis）是由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis, Mb）引起的一种慢性人兽共患传染病,给畜牧业发展和公共卫生带来了严重危害。Mb成功侵入巨噬细胞并在其胞内存活是其致病机制中的重要环节。因此,解析与细胞入侵相关的蛋白的功能将有助于控制牛结核病。牛分枝杆菌Mb1514基因编码一种推定侵入蛋白（本研究将其命名MbINV蛋白）,但其确切功能尚不明确。本研究利用基因重组技术对该基因进行了克隆、原核表达、纯化和复性,首次成功获得了重组蛋白,并利用鼠巨噬细胞模型RAW264.7初步解析了该蛋白的生物功能。为更深入地研究该基因的功能和在机体免疫调节中的作用,成功构建了该基因的绿色荧光融合蛋白穿梭表达载体,并将其电转化至耻垢分枝杆菌后获得了重组菌株。具体研究内容如下：1.以Mb的DNA为模板,PCR扩增Mb1514基因并将其克隆至pEASY-T1载体。测序结果表明,克隆所得基因与GenBank上所公布的M. bovis AF2122/97的Mb1514基因序列100%同源。将该基因插入到原核表达载体pET-28a（+）中构建重组表达质粒,将其转化... 

【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：87 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
目录
插图和附表清单
英文缩略词表
第一章 文献综述
    1.1 牛结核病病原学研究
        1.1.1 牛结核病病原学
        1.1.2 病原基因组学研究
    1.2 牛结核病的发生与流行情况
        1.2.1 国外牛结核病的流行情况
        1.2.2 我国牛结核病的流行情况
    1.3 牛结核病的控制策略
    1.4 结核病致病机制的研究进展
        1.4.1 结核分枝杆菌感染宿主细胞的生物学过程
        1.4.2 结核分枝杆菌感染与细胞因子调控
    1.5 Mb1514基因的研究进展
    1.6 本课题的研究意义
第二章 Mb1514基因的原核表达与纯化
    引言
    2.1 材料
        2.1.1 牛分枝杆菌菌株
        2.1.2 宿主菌株和质粒
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 实验所用溶液及配制
        2.1.5 主要仪器设备
        2.1.6 数据分析软件
    2.2 方法
        2.2.1 牛分枝杆菌的培养
        2.2.2 细菌基因组的提取
        2.2.3 引物设计
        2.2.4 Mb1514基因的克隆
        2.2.5 Mb1514原核表达载体的构建
        2.2.6 重组质粒诱导表达条件的优化
        2.2.7 SDS-PAGE分析
        2.2.8 包涵体蛋白的纯化和复性
        2.2.9 重组蛋白的Western blotting检测
    2.3 结果
        2.3.1 Mb1514基因的PCR扩增和阳性克隆的筛选
        2.3.2 Mb1514基因序列分析
        2.3.3 Mb1514基因原核表达载体的构建
        2.3.4 MbINV重组蛋白的SDS-PAGE分析与纯化
        2.3.5 重组蛋白的Western blotting鉴定
    2.4 讨论与小结
第三章 重组蛋白MbINV与巨噬细胞相互作用的研究
    引言
    3.1 材料
        3.1.1 细胞
        3.1.2 宿主菌和载体
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 实验所用溶液及其配制
        3.1.5 主要仪器与设备
    3.2 方法
        3.2.1 小鼠巨噬细胞RAW264.7的培养
        3.2.2 重组蛋白对巨噬细胞活性的影响（CCK-8法）
        3.2.3 重组蛋白引起的巨噬细胞死亡方式的测定
        3.2.4 重组蛋白刺激巨噬细胞后对促炎细胞因子mRNA表达量的影响
        3.2.5 重组蛋白细胞侵入功能的测定
        3.2.6 统计学分析
    3.3 结果
        3.3.1 重组蛋白对巨噬细胞活性的影响
        3.3.2 重组蛋白引起的巨噬细胞死亡方式的检测
        3.3.3 促炎细胞因子荧光定量PCR标准曲线的建立
        3.3.4 重组蛋白刺激巨噬细胞后促炎因子mRNA表达量的变化
        3.3.5 重组蛋白细胞侵入功能的测定
    3.4 讨论与小结
第四章 MbINV绿色荧光融合蛋白穿梭表达质粒的构建和重组耻垢分枝杆菌的筛选
    引言
    4.1 材料
        4.1.1 菌株
        4.1.2 宿主菌和质粒
        4.1.3 主要试剂
        4.1.4 实验所用溶液及配制
        4.1.5 主要仪器设备
        4.1.6 分析工具软件
    4.2 方法
        4.2.1 引物设计
        4.2.2 EGFP基因的扩增和穿梭表达载体的构建
        4.2.3 Mb1514基因的扩增和Mb1514-EGFP-pLAM12的构建
        4.2.4 Mb1514-EGFP-pLAM12重组耻垢分枝杆菌的筛选
    4.3 结果
        4.3.1 EGFP基因的PCR扩增
        4.3.2 EGFP-pLAM12重组质粒的PCR鉴定
        4.3.3 EGFP序列分析
        4.3.4 EGFP重组耻垢分枝杆菌的筛选和鉴定
        4.3.5 Mb1514基因的PCR扩增
        4.3.6 Mb1514-EGFP-pLAM12重组穿梭表达载体的酶切鉴定和测序
        4.3.7 重组耻垢分枝杆菌的筛选
    4.4 讨论与小结
结论
创新
参考文献
致谢
附录
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]牛结核病流行特点及防控措施[J]. 郭爱珍,陈焕春.  中国奶牛. 2010(11)
[2]结核病的化学治疗及面临的挑战[J]. 马玙.  中国医学科学院学报. 2009(04)
[3]陕西省关中地区奶牛结核病调查[J]. 段旭基,张鹏,王波,张淑霞,党如意,杨增岐.  中国动物检疫. 2009(07)
[4]奶牛结核病流行病学调查研究[J]. 郭开彬.  草业与畜牧. 2008(12)
[5]牛分枝杆菌MPB51基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达[J]. 姜秀云,王春凤,王春芳,何昭阳.  微生物学报. 2005(02)



本文编号：3150150