敖汉细毛羊Hoxa7基因表达载体的构建及在成纤维细胞中的表达

发布时间：2021-04-21 05:04

　　为了构建敖汉细毛羊Hoxa7基因表达载体以及研究表达载体转染成纤维细胞后基因表达量的变化,试验从40日龄敖汉细毛羊肩部皮肤提取RNA并反转录成cDNA,参照GenBank中Hoxa7基因的CDS区序列设计1对引物;将PCR扩增获取的Hoxa7基因CDS片段连接到pEASYTM-T1载体上,构建pEASYTM-T1-Hoxa7克隆载体,将克隆载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中;从pEASYTM-T1载体上切下Hoxa7基因片段,连接到pcDNA3.1表达载体上,再次转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中;将重组表达载体pcDNA3.1-Hoxa7瞬时转染到传代的成纤维细胞中,利用实时荧光定量PCR技术、Western-blot方法检测成纤维细胞中Hoxa7基因的mRNA和蛋白表达情况。结果表明:重组表达载体pcDNA3.1-Hoxa7构建成功;瞬时转染到成纤维细胞中后, Hoxa7基因的mRNA和蛋白表达量均极显著升高（P<0.01）。说明敖汉细毛羊Hoxa7基因在成纤维细胞中能够高效表达。 

【文章来源】：黑龙江畜牧兽医. 2020,(11)北大核心

【文章页数】：7 页

【文章目录】：
1 材料
    1.1 试验动物
    1.2 主要试剂
    1.3 主要仪器
2 方法
    2.1 引物的设计与合成
    2.2 目的基因的PCR扩增
    2.3 TA克隆测序
    2.4 Hoxa7基因与pcDNA3.1表达载体重组
    2.5 成纤维细胞的培养与转染
    2.6 实时荧光定量PCR扩增
    2.7 Hoxa7基因编码蛋白的检测
    2.8 数据的统计分析
3 结果与分析
    3.1 Hoxa7基因的PCR扩增
    3.2 TA克隆测序
    3.3 Hoxa7基因与pcDNA3.1表达载体重组
        3.3.1 克隆载体的鉴定及提取
        3.3.2 克隆载体及pcDNA3.1表达载体双酶切
        3.3.3 pcDNA3.1表达载体与Hoxa7基因的连接鉴定
        3.3.4 重组表达载体菌液的测序
    3.4 成纤维细胞观察
        3.4.1 原代细胞观察
        3.4.2 传代细胞观察
    3.5 实时荧光定量PCR扩增
    3.6 Hoxa7基因编码蛋白的检测
4 讨论
5 结论


【参考文献】：
期刊论文
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[2]HOXA7在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义[J]. 陈浩,段晓峰,朴正国,欧阳可雄,Muy-Teck Teh,马洪.  贵州医药. 2017(09)
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[4]皮肤毛囊发育的转录组研究进展[J]. 江玮,范一星,乔贤,张燕军,刘志红,赵艳红,王瑞军,王志新,张文广,苏蕊,李金泉.  遗传. 2015(06)
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[7]哺乳动物毛囊结构特征及调控机制[J]. 马馨,陈洋,姜怀志.  中国草食动物科学. 2013(01)
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[9]敖汉细毛羊[J]. 宗泽君,孙德欣.  农村养殖技术. 2004(20)
[10]敖汉细毛羊品种形成与发展前景[J]. 刘海山,李恒荣,于洪杰,刘俊茹,张富.  当代畜禽养殖业. 2001(08)

博士论文
[1]影响绵羊毛纤维与毛囊结构及生产性状的分子机理研究[D]. 李树伟.吉林大学 2008



本文编号：3151114