EHV-1多克隆抗体的制备及其皮层蛋白UL16的原核表达

发布时间：2021-04-21 11:42

　　马鼻肺炎（Equine rhinopneumonitis,ER）是由马疱疹病毒 Ⅰ 型（Equine herpes virus type 1,EHV-1）和马疱疹病毒 Ⅳ 型（Equine herpesvirus type 4,EHV-4）引起的主要感染马属动物的高度接触性传染病。该病不仅可以表现不同程度的呼吸道症状,EHV-1还可以导致流产和致死的马脊髓性脑炎,给养马业带来严重的威胁。UL16蛋白为EHV-1的皮层蛋白之一,由ORF46编码,基因高度保守,在病毒复制和成熟过程中起重要作用。本实验的目的是制备EHV-1兔多克隆抗体,并通过原核表达系统获取体外表达的UL16蛋白。利用蔗糖梯度离心法将EHV-1 438/77株进行纯化,将纯化的病毒蛋白与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂进行乳化,分别对家兔进行首次免疫和加强免疫制备免疫血清;通过Westerm Blot检测显示,制备的EHV-1兔免疫血清中的多抗与EHV-1全病毒蛋白结合反应性良好。根据在GenBank上发表的ORF46基因的序列设计特异性引物,在引物末端引入EcoRI和XhoI两个酶切位点,通过PCR来扩增目的片段。纯化的PC... 

【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区

【文章页数】：43 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 引言
    1.1 马鼻肺炎概述
    1.2 马疱疹病毒的分型及其生物学特性
        1.2.1 马疱疹病毒的分型
        1.2.2 病毒的形态结构
        1.2.3 病毒的基因组结构
        1.2.4 病毒的理化性质
        1.2.5 主要蛋白功能
        1.2.6 致病机制
        1.2.7 潜伏感染
    1.3 临床症状
    1.4 流行病学
    1.5 临床诊断
    1.6 实验室诊断
        1.6.1 组织学诊断
        1.6.2 病毒的分离鉴定
        1.6.3 聚合酶链式反应
        1.6.4 血清中和实验
        1.6.5 酶联免疫吸附实验
        1.6.6 直接免疫荧光
    1.7 马鼻肺炎的防控措施
    1.8 疫苗的研究进展
    1.9 本实验的目的和意义
2 试验一 EHV-1全病毒兔的多克隆抗体的制备
    2.1 材料
        2.1.1 细胞、毒株、及实验动物
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器和耗材
    2.2 方法
        2.2.1 病毒感染滴度的测定
        2.2.2 细胞的培养和病毒的增殖
        2.2.3 病毒的浓缩和纯化
        2.2.4 病毒蛋白的乳化
        2.2.5 动物免疫及免疫血清的制备
        2.2.6 多抗的Western Blot鉴定
    2.3 结果与分析
        2.3.1 病毒感染滴度的测定结果
        2.3.2 病毒最适接毒量计算结果
        2.3.3 病毒超速离心结果
        2.3.4 兔多抗的Wetern Blot鉴定
3 试验二 EHV-1 UL16蛋白原核表达
    3.1 材料
        3.1.1 菌株、质粒、毒株及抗体
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器和耗材
    3.2 方法
        3.2.1 引物设计
        3.2.2 UL16基因的获取
        3.2.3 重组克隆质粒的构建及鉴定
        3.2.4 重组表达质粒的构建及鉴定
        3.2.5 重组表达质粒的诱导表达
        3.2.6 重组UL16蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析
        3.2.7 重组UL16蛋白表达的Western Blot鉴定
    3.3 结果与分析
        3.3.1 PCR反应结果
        3.3.2 重组克隆质粒双酶切鉴定结果
        3.3.3 重组表达质粒双酶切鉴定结果
        3.3.4 重组表达质粒测序及比对结果
        3.3.5 SDS-PAGE分析
        3.3.6 Western Blot鉴定
4 讨论
5 结论
致谢
参考文献
附录
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]EHV-1皮层蛋白VP22生物信息学分析及亚细胞定位研究[J]. 王世民,王浩,阿依古丽·艾麦尔尼亚孜,郝翠兰,姚刚.  黑龙江畜牧兽医. 2018(21)
[2]2018年生效的须申报OIE的传染病和寄生虫病名录[J]. 李克斌.  兽医导刊. 2018(03)
[3]我国马鼻肺炎流行现状[J]. 罗蔼剑,张莹,刁巧虹,龚凤平,卢刚,鱼海琼,孙凌霜.  中国兽医杂志. 2016(11)
[4]马疱疹病毒1型（EHV-1）gC蛋白的原核表达及其免疫原性分析[J]. 王美月,胡哲,何佳,刘荻萩,王晓钧.  中国病原生物学杂志. 2016(10)
[5]新疆伊犁地区马疱疹病毒1型的分离与鉴定[J]. 杨永龙,刘建华,宋焕堂,李静,卢亚宾,胡月,范斌,况玲,冉多良.  中国预防兽医学报. 2016(07)
[6]马疱疹病毒抗体间接ELISA检测方法的建立[J]. 宋焕堂,孙建华,杜润慈,刘建华,冉多良.  畜牧与兽医. 2016(06)
[7]新疆部分地区马鼻肺炎的血清学调查[J]. 李娜,孙建华,石明,徐全圆,杨夷平,刘建华,加尔肯,冉多良.  动物医学进展. 2014(09)
[8]马鼻肺炎诊断方法研究进展[J]. 鱼海琼,张树,林志雄,罗长保,赵吟,田纯见,李守军.  中国动物检疫. 2014(02)
[9]新疆地区马鼻肺炎血清学调查[J]. 阿依吐拉·肉孜,阿孜古丽,肖开提,马伟,田志革,林汉亮.  中国畜牧兽医文摘. 2013(12)
[10]马鼻肺炎的诊断与预防浅析[J]. 张海兰,比尔来西肯·赛都力,阿曼吐尔,王一明.  当代畜禽养殖业. 2013(09)

硕士论文
[1]新疆伊犁地区马疱疹病毒1型的分离鉴定及其gB和gD基因的序列分析[D]. 杨永龙.新疆农业大学 2016
[2]新疆2县马场流行病学调查及两种马鼻肺炎间接ELISA检测方法的比较研究[D]. 沙燕.新疆农业大学 2015
[3]马疱疹病毒1型gB/gD双基因原核表达蛋白免疫效果研究以及新疆部分地区马鼻肺炎血清流行病学调查[D]. 李娜.新疆农业大学 2014
[4]EHV-8的分离鉴定和生物学特性分析[D]. 刘翠云.中国农业科学院 2012
[5]马鼻肺炎间接ELISA诊断方法的建立及血清学调查[D]. 陶虹.新疆农业大学 2002



本文编号：3151691