四环素类药物受体的制备及进化
发布时间：2021-04-21 16:00
兽药在畜牧业快速发展过程中发挥着不可替代的作用,四环素类药物作为一类广谱抗生素被广泛用于治疗动物的多种感染性疾病。但此类药物在动物性食品中的残留会给消费者带来一系列潜在的健康危害。本论文的目的是制备出四环素类药物的受体TetR蛋白并对其进行定向进化,以其为识别元件建立新型免疫法对此类药物在动物性食品中的残留进行检测。首先,研究者从四环素耐药菌中提取总DNA,利用PCR技术扩增出TetR蛋白的基因,将其插入表达载体并导入BL21（DE3）感受态细胞中进行表达。结果表明,该TetR蛋白的分子量为44 KDa,能同时识别5种四环素类药物,IC50为2.37-31 ng/mL。分子对接的结果表明,该受体的结合位点由12个氨基酸组成,它们主要通过疏水作用力和pi-pi键与药物分子中的D环发生结合。以该TetR蛋白为核心试剂建立的竞争化学发光免疫法可以对牛奶中的这5种四环素类药物进行检测,检测限为1.24-15.7 ng/mL,添加回收率为77-96%。然后,研究者对TetR蛋白中的关键接触氨基酸分别进行了虚拟突变。结果表明,将105位脯氨酸突变为苯丙氨酸和酪氨酸时,受体的稳定性明显提升。于是研究...
【文章来源】：河北农业大学河北省
【文章页数】：93 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
1.1 四环素类药物概述
1.1.1 理化性质
1.1.2 作用机制
1.1.3 药物残留及其危害
1.2 四环素类药物残留检测方法现状
1.2.1 微生物法
1.2.2 理化检测法
1.2.3 免疫分析方法
1.2.4 其它
1.3 受体
1.3.1 受体免疫分析法
1.3.2 受体免疫分析法应用于兽药残留检测
1.3.3 TetR蛋白
1.4 分子对接及定向进化
1.4.1 受体空间结构预测
1.4.2 分子对接
1.4.3 定点突变技术
1.5 研究目的和意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 药品与试剂
2.1.2 所用仪器
2.1.3 所用溶液
2.1.4 所用软件
2.2 TetR受体的制备及鉴定
2.2.1 合成引物
2.2.2 四环素耐药菌复苏
2.2.3 TetR基因的扩增和纯化
2.2.4 酶切载体及基因
2.2.5 目的片段与重组载体连接及转化
2.2.6 TetR受体的原核表达
2.2.7 TetR受体的纯化
2.2.8 TetR受体的鉴定
2.2.9 添加回收实验
2.3 TetR受体的体外进化
2.3.1 序列对比
2.3.2 同源建模
2.3.3 分子对接
2.3.4 构建TetR突变体模型
2.3.5 TetR突变体分子对接
2.3.6 合成突变体引物
2.3.7 定点突变
2.3.8 突变质粒转化
2.3.9 诱导TetR突变体表达
2.3.10 TetR突变体纯化
2.3.11 TetR突变体的鉴定
2.4 固相分散微萃取结合超高效液相（MOF-MIP-DSPME-UPLC）方法的建立
2.4.1 金属-有机框架材料（MOF）的制备
2.4.2 MOF-MIP的制备及检验
2.4.3 UPLC条件
2.4.4 添加回收实验
3 结果与分析
3.1 TetR受体的制备
3.1.1 TetR基因
3.1.2 重组表达载体
3.1.3 TetR受体诱导表达
3.1.4 TetR受体纯化
3.1.5 建立化学发光法检测牛奶中四环素药物残留
3.1.6 样品检测
3.2 同源建模及体外进化
3.2.1 序列对比
3.2.2 同源建模
3.2.3 分子对接
3.2.4 构建突变体模型
3.2.5 突变体分子对接
3.2.6 定点突变及突变体基因
3.2.7 TetR突变体的表达及纯化
3.2.8 建立竞争荧光免疫法检测鸡蛋中四环素药物残留
3.2.9 样品提取及添加回收
3.3 MOF-MIP- DSPME-UPLC方法的建立及应用
3.3.1 MOF和MOF-MIP的检验
3.3.2 MOF-MIP的性能
3.3.3 样品检测
4 讨论
4.1 TetR受体的分子识别机制
4.2 体外进化
4.2.1 分子对接
4.2.2 定点突变
4.3 相关方法的比较
4.4 展望
5 结论
5.1 成功制备出了四环素类药物的受体TetR蛋白
5.2 成功对TetR蛋白进行了体外定向进化
5.3 建立了MOF-MIP-DSPME-UPLC法
参考文献
在读期间发表论文
作者简介
致谢
附录
【参考文献】：
期刊论文
[1]酶比色法测定特殊医学用途婴儿配方食品中的胆碱含量[J]. 柯燕娜,张玉柱,鲍笑岭,裴炜. 乳业科学与技术. 2020(01)
[2]基于荧光光谱、表面等离子体共振、分子对接技术的天然产物中14-3-3τ蛋白抑制剂的筛选[J]. 何田,贾玮娟,王弯弯,王弘. 国际药学研究杂志. 2019(08)
[3]光谱法及分子对接技术研究黄体酮与牛血清白蛋白的结合机制[J]. 杨淑玲,廖先萍,范星,庹浔. 发光学报. 2019(11)
[4]基于碳点-铕的比率荧光探针可视化检测四环素[J]. 杨伟强,张桂云,林华,倪建聪,黄玲凤. 高等学校化学学报. 2019(11)
[5]一种鸡肉中四环素类兽药残留高效液相色谱检测方法的建立[J]. 王余磊,舒相华,张雪,高云梅,杨崑,张雅靖,吕涛,宋春莲. 甘肃畜牧兽医. 2019(10)
[6]非水毛细管电泳在手性分离中的应用进展[J]. 王超越,孙文宇,吕华伟,颜继忠,童胜强. 理化检验(化学分册). 2019(10)
[7]毛细管电泳检测技术专利状况分析[J]. 田裕,胡正耀. 分析试验室. 2019(09)
[8]竞争化学发光酶免疫检测动物源性食品中四环素残留[J]. 栾军,王毅谦,龙云凤,张晓燕,柳菡,蒋鲁岩,高玲,封振,马丽. 食品工业科技. 2020(04)
[9]超高效液相色谱串联质谱法检测水产品中四环素类药物及其差向异构体[J]. 李佩佩,张小军,严忠雍,陈思,张帅,方益,龙举. 中国食品学报. 2019(07)
[10]检测利巴韦林残留的化学发光酶免疫法建立[J]. 何方洋,崔廷婷,王兆芹,顾蓉蓉,冯月君,蒋金峰,丛倩千,杨春艳. 畜牧与兽医. 2019(06)
博士论文
[1]氨基酸突变对四种蛋白质与其配体相互作用影响的分子动力学模拟研究[D]. 牛瑞娟.吉林大学 2019
[2]基于群智能算法的蛋白质结构预测研究[D]. 陈烨.中国矿业大学 2018
[3]蛋白质结构从头预测构象空间优化理论与方法[D]. 周晓根.浙江工业大学 2018
[4]比例型荧光探针的设计合成及生物应用研究[D]. 李新然.兰州大学 2018
[5]基于适配体识别—化学发光功能化纳米探针的食品安全危害因子检测方法研究[D]. 郝丽玲.江南大学 2017
[6]土壤—蔬菜系统中四环素类抗生素迁移积累与污染的细胞诊断方法[D]. 刘娣.浙江大学 2017
[7]基于受体蛋白MphR（A和E）的类ELISA构建及在大环内酯类药物残留检测的初步应用[D]. 程永友.中国农业科学院 2016
[8]动物性食品中喹噁啉类药物代谢物和磺胺类—喹诺酮类药物多残留免疫分析方法研究[D]. 蒋文晓.中国农业大学 2014
[9]G蛋白偶联受体与小分子配体相互作用机制的分子模拟研究[D]. 白启峰.兰州大学 2014
[10]鸡肉中金刚烷胺残留的生物识别材料研究与亲和检测方法建立[D]. 孙海新.中国海洋大学 2013
硕士论文
[1]同源异效桑源药材（桑叶、桑枝、桑白皮、桑椹）的物质基础研究[D]. 成胜荣.江苏大学 2019
[2]基于酶抑制与铜介导的荧光分析法用于有机磷农药的检测[D]. 黄念.广西师范大学 2019
[3]几种中药有效成分与生物大分子相互作用机制的光谱法及分子对接研究[D]. 吴鋆.长春师范大学 2019
[4]微生物法生产甘油酸的发酵及提取工艺研究[D]. 姚浩轲.河南大学 2019
[5]基于分子对接的海水鱼ACE抑制三肽鉴定及作用机制研究[D]. 樊玥.渤海大学 2019
[6]两类催眠镇静药的残留检测方法研究[D]. 夏婉秋.河北农业大学 2019
[7]通过氨基酸定点突变调控水稻OsHAL3蛋白功能的研究[D]. 仝泽方.沈阳农业大学 2018
[8]30%土霉素注射液组方的改进和制备工艺的优化[D]. 李双江.河北农业大学 2018
[9]吩噻嗪类药物单链抗体的制备及进化[D]. 史芳舒.河北农业大学 2018
[10]等度洗脱HPLC法灵敏检测四环素类抗生素及其差向异构体的研究[D]. 赖晓静.南昌大学 2018
本文编号：3152058
【文章来源】：河北农业大学河北省
【文章页数】：93 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
1.1 四环素类药物概述
1.1.1 理化性质
1.1.2 作用机制
1.1.3 药物残留及其危害
1.2 四环素类药物残留检测方法现状
1.2.1 微生物法
1.2.2 理化检测法
1.2.3 免疫分析方法
1.2.4 其它
1.3 受体
1.3.1 受体免疫分析法
1.3.2 受体免疫分析法应用于兽药残留检测
1.3.3 TetR蛋白
1.4 分子对接及定向进化
1.4.1 受体空间结构预测
1.4.2 分子对接
1.4.3 定点突变技术
1.5 研究目的和意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 药品与试剂
2.1.2 所用仪器
2.1.3 所用溶液
2.1.4 所用软件
2.2 TetR受体的制备及鉴定
2.2.1 合成引物
2.2.2 四环素耐药菌复苏
2.2.3 TetR基因的扩增和纯化
2.2.4 酶切载体及基因
2.2.5 目的片段与重组载体连接及转化
2.2.6 TetR受体的原核表达
2.2.7 TetR受体的纯化
2.2.8 TetR受体的鉴定
2.2.9 添加回收实验
2.3 TetR受体的体外进化
2.3.1 序列对比
2.3.2 同源建模
2.3.3 分子对接
2.3.4 构建TetR突变体模型
2.3.5 TetR突变体分子对接
2.3.6 合成突变体引物
2.3.7 定点突变
2.3.8 突变质粒转化
2.3.9 诱导TetR突变体表达
2.3.10 TetR突变体纯化
2.3.11 TetR突变体的鉴定
2.4 固相分散微萃取结合超高效液相（MOF-MIP-DSPME-UPLC）方法的建立
2.4.1 金属-有机框架材料（MOF）的制备
2.4.2 MOF-MIP的制备及检验
2.4.3 UPLC条件
2.4.4 添加回收实验
3 结果与分析
3.1 TetR受体的制备
3.1.1 TetR基因
3.1.2 重组表达载体
3.1.3 TetR受体诱导表达
3.1.4 TetR受体纯化
3.1.5 建立化学发光法检测牛奶中四环素药物残留
3.1.6 样品检测
3.2 同源建模及体外进化
3.2.1 序列对比
3.2.2 同源建模
3.2.3 分子对接
3.2.4 构建突变体模型
3.2.5 突变体分子对接
3.2.6 定点突变及突变体基因
3.2.7 TetR突变体的表达及纯化
3.2.8 建立竞争荧光免疫法检测鸡蛋中四环素药物残留
3.2.9 样品提取及添加回收
3.3 MOF-MIP- DSPME-UPLC方法的建立及应用
3.3.1 MOF和MOF-MIP的检验
3.3.2 MOF-MIP的性能
3.3.3 样品检测
4 讨论
4.1 TetR受体的分子识别机制
4.2 体外进化
4.2.1 分子对接
4.2.2 定点突变
4.3 相关方法的比较
4.4 展望
5 结论
5.1 成功制备出了四环素类药物的受体TetR蛋白
5.2 成功对TetR蛋白进行了体外定向进化
5.3 建立了MOF-MIP-DSPME-UPLC法
参考文献
在读期间发表论文
作者简介
致谢
附录
【参考文献】：
期刊论文
[1]酶比色法测定特殊医学用途婴儿配方食品中的胆碱含量[J]. 柯燕娜,张玉柱,鲍笑岭,裴炜. 乳业科学与技术. 2020(01)
[2]基于荧光光谱、表面等离子体共振、分子对接技术的天然产物中14-3-3τ蛋白抑制剂的筛选[J]. 何田,贾玮娟,王弯弯,王弘. 国际药学研究杂志. 2019(08)
[3]光谱法及分子对接技术研究黄体酮与牛血清白蛋白的结合机制[J]. 杨淑玲,廖先萍,范星,庹浔. 发光学报. 2019(11)
[4]基于碳点-铕的比率荧光探针可视化检测四环素[J]. 杨伟强,张桂云,林华,倪建聪,黄玲凤. 高等学校化学学报. 2019(11)
[5]一种鸡肉中四环素类兽药残留高效液相色谱检测方法的建立[J]. 王余磊,舒相华,张雪,高云梅,杨崑,张雅靖,吕涛,宋春莲. 甘肃畜牧兽医. 2019(10)
[6]非水毛细管电泳在手性分离中的应用进展[J]. 王超越,孙文宇,吕华伟,颜继忠,童胜强. 理化检验(化学分册). 2019(10)
[7]毛细管电泳检测技术专利状况分析[J]. 田裕,胡正耀. 分析试验室. 2019(09)
[8]竞争化学发光酶免疫检测动物源性食品中四环素残留[J]. 栾军,王毅谦,龙云凤,张晓燕,柳菡,蒋鲁岩,高玲,封振,马丽. 食品工业科技. 2020(04)
[9]超高效液相色谱串联质谱法检测水产品中四环素类药物及其差向异构体[J]. 李佩佩,张小军,严忠雍,陈思,张帅,方益,龙举. 中国食品学报. 2019(07)
[10]检测利巴韦林残留的化学发光酶免疫法建立[J]. 何方洋,崔廷婷,王兆芹,顾蓉蓉,冯月君,蒋金峰,丛倩千,杨春艳. 畜牧与兽医. 2019(06)
博士论文
[1]氨基酸突变对四种蛋白质与其配体相互作用影响的分子动力学模拟研究[D]. 牛瑞娟.吉林大学 2019
[2]基于群智能算法的蛋白质结构预测研究[D]. 陈烨.中国矿业大学 2018
[3]蛋白质结构从头预测构象空间优化理论与方法[D]. 周晓根.浙江工业大学 2018
[4]比例型荧光探针的设计合成及生物应用研究[D]. 李新然.兰州大学 2018
[5]基于适配体识别—化学发光功能化纳米探针的食品安全危害因子检测方法研究[D]. 郝丽玲.江南大学 2017
[6]土壤—蔬菜系统中四环素类抗生素迁移积累与污染的细胞诊断方法[D]. 刘娣.浙江大学 2017
[7]基于受体蛋白MphR（A和E）的类ELISA构建及在大环内酯类药物残留检测的初步应用[D]. 程永友.中国农业科学院 2016
[8]动物性食品中喹噁啉类药物代谢物和磺胺类—喹诺酮类药物多残留免疫分析方法研究[D]. 蒋文晓.中国农业大学 2014
[9]G蛋白偶联受体与小分子配体相互作用机制的分子模拟研究[D]. 白启峰.兰州大学 2014
[10]鸡肉中金刚烷胺残留的生物识别材料研究与亲和检测方法建立[D]. 孙海新.中国海洋大学 2013
硕士论文
[1]同源异效桑源药材（桑叶、桑枝、桑白皮、桑椹）的物质基础研究[D]. 成胜荣.江苏大学 2019
[2]基于酶抑制与铜介导的荧光分析法用于有机磷农药的检测[D]. 黄念.广西师范大学 2019
[3]几种中药有效成分与生物大分子相互作用机制的光谱法及分子对接研究[D]. 吴鋆.长春师范大学 2019
[4]微生物法生产甘油酸的发酵及提取工艺研究[D]. 姚浩轲.河南大学 2019
[5]基于分子对接的海水鱼ACE抑制三肽鉴定及作用机制研究[D]. 樊玥.渤海大学 2019
[6]两类催眠镇静药的残留检测方法研究[D]. 夏婉秋.河北农业大学 2019
[7]通过氨基酸定点突变调控水稻OsHAL3蛋白功能的研究[D]. 仝泽方.沈阳农业大学 2018
[8]30%土霉素注射液组方的改进和制备工艺的优化[D]. 李双江.河北农业大学 2018
[9]吩噻嗪类药物单链抗体的制备及进化[D]. 史芳舒.河北农业大学 2018
[10]等度洗脱HPLC法灵敏检测四环素类抗生素及其差向异构体的研究[D]. 赖晓静.南昌大学 2018
本文编号：3152058
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