猪痘病毒的分离鉴定及表达PCV2衣壳蛋白重组猪痘病毒的构建
发布时间：2021-04-24 02:50
猪痘（Swinepox）是由猪痘病毒（Swinepox Virus,SWPV）引起猪的一种以皮肤形成痘疹和结痂为特征的传染病,绝大部分感染猪能自行康复,对养猪业造成的损失极小。SWPV具有基因组大（146kb）、含有多个复制非必需区、可以插入大片段的外源基因、严格的宿主特异性等特点,使其特别适合作为活疫苗载体。为建立重组猪痘病毒疫苗载体技术平台,本研究从江西地区分离到一株猪痘病毒,以该分离毒株为亲本病毒,采用同源重组技术构建表达猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus type 2,PCV2）衣壳蛋白的重组猪痘病毒。1.猪痘病毒的分离与鉴定从江西省某猪场疑似猪痘的育肥猪皮肤痘痂中进行病毒分离,分离到一株猪痘病毒,命名为JX-20G株。参考GenBank登录的SWPV（AF410153.1）,设计 SPV027-029、SPV043-044、SPV063、SPV071 4 对引物,以 JX-20G株DNA作为模板,分别进行PCR扩增,扩增到1688bp、1560bp、960bp、975bp的特异性目的条带,通过序列分析,获得了 SPV027、SPV028、SPV043、SPV...
【文章来源】：江西农业大学江西省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩写词表
第一章 文献综述
1.1 猪痘病毒研究进展
1.1.1 猪痘病毒的形态学及理化特性
1.1.2 猪痘病毒的理化特性
1.1.3 猪痘的发病概况
1.1.4 猪痘病毒分子生物学特性
1.1.5 猪痘病毒作为载体的研究进展
1.2 猪圆环病毒2型研究进展
1.2.1 猪圆环病毒2型病原学
1.2.2 猪圆环病毒2型基因结构与功能
1.3 猪圆环病毒2型疫苗研究进展
1.3.1 灭活苗
1.3.2 弱毒疫苗
1.3.3 基因工程苗
第二章 猪痘病毒JX-20G株的分离与鉴定
2.1 实验材料
2.1.1 病料及细胞株
2.1.2 实验试剂及配制
2.1.3 实验器材
2.1.4 引物设计
2.2 实验方法
2.2.1 猪痘病毒的分离
2.2.2 猪痘病毒分离毒株的鉴定
2.3 结果
2.3.1 猪痘病毒的分离
2.3.2 猪痘病毒的鉴定
2.3.3 猪痘病毒基因序列及推导的氨基酸序列同源性分析
2.3.4 猪痘病毒基因与其它痘病毒属基因的同源基因进化关系
2.3.5 病毒粒子的电镜观察
2.4 讨论
2.4.1 猪痘病毒的PK15细胞培养特性
2.4.2 猪痘病毒JX-20G株序列分析
2.4.3 猪痘病毒JX-20G株病毒粒子的电镜观察
2.5 小结
第三章 猪圆环病毒2型全基因组克隆及序列分析
3.1 实验材料
3.1.1 质粒、菌株和毒株
3.1.2 主要试剂
3.1.3 试剂配制
3.1.4 主要仪器设备
3.1.5 引物设计
3.2 实验方法
3.2.1 病毒DNA的提取
3.2.2 PCR扩增
3.2.3 PCR产物纯化
3.2.4 连接
3.2.5 转化
3.2.6 PCR鉴定
3.2.7 分离毒株的同源性及进化分析
3.3 结果
3.3.1 PCV2型全基因组的PCR结果
3.3.2 PCV2全基因及部分主要基因序列同源性分析
3.3.3 PCV2 ORF2基因推导的氨基酸序列分析
3.3.4 PCV2及PCV2 ORF2基因遗传进化树分析
3.4 讨论
第四章 表达PCV2衣壳蛋白重组猪痘病毒的构建
4.1 实验材料
4.1.1 细胞和病毒
4.1.2 主要试剂及配制
4.1.3 主要仪器设备
4.1.4 P11、P7.5和P28启动子序列
4.1.5 引物设计
4.2 pSWE 1-28C、pSWE11-7.5C载体构建实验方法
4.2.1 SWPV的培养
4.2.2 病毒DNA的提取
4.2.3 TK1、TK2和P11-egfp基因的PCR扩增
4.2.4 P7.5启动子、P7.5-Cap和P28-Cap片段的PCR扩增
4.2.5 转移载体的构建
4.2.6 pSWE11-28C载体的构建
4.2.7 pSWE11-7.5C载体的构建
4.3 pSW-E11-28C、pSW-E11-7.5C重组质粒转染及重组病毒纯化
4.3.1 转染质粒的提取及浓度测定
4.3.2 转染过程
4.3.3 重组病毒的纯化
4.3.4 重组病毒的PCR鉴定
4.3.5 重组病毒的Western blotting分析
4.3.6 重组病毒超薄切片观察
4.3.7 重组病毒的遗传稳定性实验
4.4 实验结果
4.4.1 重组臂和egfp基因的扩增结果
4.4.2 P7.5-Cap、P28-Cap和P7.5启动子基因的PCR结果
4.4.3 转移载体pSWE11的酶切鉴定
4.4.4 重组载体pSWE11-28C和pSWE11-7.5C的酶切验证
4.4.5 转染
4.4.6 重组病毒的纯化
4.4.7 重组病毒的PCR鉴定
4.4.8 重组病毒的Western blotting分析
4.4.9 重组病毒超薄切片观察
4.4.10 重组病毒的遗传稳定性实验
4.5 讨论
4.5.1 猪痘病毒TK基因作为外源片段插入位点
4.5.2 筛选基因的选择
4.5.3 表达Cap蛋白重组猪痘病毒作为活载体疫苗
4.6 小结
全文总结
参考文献
附件
致谢
本文编号：3156529
【文章来源】：江西农业大学江西省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩写词表
第一章 文献综述
1.1 猪痘病毒研究进展
1.1.1 猪痘病毒的形态学及理化特性
1.1.2 猪痘病毒的理化特性
1.1.3 猪痘的发病概况
1.1.4 猪痘病毒分子生物学特性
1.1.5 猪痘病毒作为载体的研究进展
1.2 猪圆环病毒2型研究进展
1.2.1 猪圆环病毒2型病原学
1.2.2 猪圆环病毒2型基因结构与功能
1.3 猪圆环病毒2型疫苗研究进展
1.3.1 灭活苗
1.3.2 弱毒疫苗
1.3.3 基因工程苗
第二章 猪痘病毒JX-20G株的分离与鉴定
2.1 实验材料
2.1.1 病料及细胞株
2.1.2 实验试剂及配制
2.1.3 实验器材
2.1.4 引物设计
2.2 实验方法
2.2.1 猪痘病毒的分离
2.2.2 猪痘病毒分离毒株的鉴定
2.3 结果
2.3.1 猪痘病毒的分离
2.3.2 猪痘病毒的鉴定
2.3.3 猪痘病毒基因序列及推导的氨基酸序列同源性分析
2.3.4 猪痘病毒基因与其它痘病毒属基因的同源基因进化关系
2.3.5 病毒粒子的电镜观察
2.4 讨论
2.4.1 猪痘病毒的PK15细胞培养特性
2.4.2 猪痘病毒JX-20G株序列分析
2.4.3 猪痘病毒JX-20G株病毒粒子的电镜观察
2.5 小结
第三章 猪圆环病毒2型全基因组克隆及序列分析
3.1 实验材料
3.1.1 质粒、菌株和毒株
3.1.2 主要试剂
3.1.3 试剂配制
3.1.4 主要仪器设备
3.1.5 引物设计
3.2 实验方法
3.2.1 病毒DNA的提取
3.2.2 PCR扩增
3.2.3 PCR产物纯化
3.2.4 连接
3.2.5 转化
3.2.6 PCR鉴定
3.2.7 分离毒株的同源性及进化分析
3.3 结果
3.3.1 PCV2型全基因组的PCR结果
3.3.2 PCV2全基因及部分主要基因序列同源性分析
3.3.3 PCV2 ORF2基因推导的氨基酸序列分析
3.3.4 PCV2及PCV2 ORF2基因遗传进化树分析
3.4 讨论
第四章 表达PCV2衣壳蛋白重组猪痘病毒的构建
4.1 实验材料
4.1.1 细胞和病毒
4.1.2 主要试剂及配制
4.1.3 主要仪器设备
4.1.4 P11、P7.5和P28启动子序列
4.1.5 引物设计
4.2 pSWE 1-28C、pSWE11-7.5C载体构建实验方法
4.2.1 SWPV的培养
4.2.2 病毒DNA的提取
4.2.3 TK1、TK2和P11-egfp基因的PCR扩增
4.2.4 P7.5启动子、P7.5-Cap和P28-Cap片段的PCR扩增
4.2.5 转移载体的构建
4.2.6 pSWE11-28C载体的构建
4.2.7 pSWE11-7.5C载体的构建
4.3 pSW-E11-28C、pSW-E11-7.5C重组质粒转染及重组病毒纯化
4.3.1 转染质粒的提取及浓度测定
4.3.2 转染过程
4.3.3 重组病毒的纯化
4.3.4 重组病毒的PCR鉴定
4.3.5 重组病毒的Western blotting分析
4.3.6 重组病毒超薄切片观察
4.3.7 重组病毒的遗传稳定性实验
4.4 实验结果
4.4.1 重组臂和egfp基因的扩增结果
4.4.2 P7.5-Cap、P28-Cap和P7.5启动子基因的PCR结果
4.4.3 转移载体pSWE11的酶切鉴定
4.4.4 重组载体pSWE11-28C和pSWE11-7.5C的酶切验证
4.4.5 转染
4.4.6 重组病毒的纯化
4.4.7 重组病毒的PCR鉴定
4.4.8 重组病毒的Western blotting分析
4.4.9 重组病毒超薄切片观察
4.4.10 重组病毒的遗传稳定性实验
4.5 讨论
4.5.1 猪痘病毒TK基因作为外源片段插入位点
4.5.2 筛选基因的选择
4.5.3 表达Cap蛋白重组猪痘病毒作为活载体疫苗
4.6 小结
全文总结
参考文献
附件
致谢
本文编号：3156529
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