猪源唾液酸黏附素介导PRRS病毒感染Marc145细胞的适应性研究

发布时间：2021-04-24 08:27

　　猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS,俗称蓝耳病）是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）引起的一种严重危害养猪业的免疫抑制性疾病。疫苗接种是预防本病的重要手段之一。但是,由于PRRSV具有严格的细胞嗜性,原代易感细胞如猪肺泡巨噬细胞（PAM）等难以满足大规模生产的需求,而继代细胞如非洲绿猴肾上皮细胞（Marc145）等因缺乏唾液酸黏附素（Sn）受体限制了某些PRRSV田间流行株的体外增殖,这十分不利于现有PRRS疫苗免疫效果的持续性评价及其疫苗种子库的建立,阻碍了PRRS疫情的防控实践。故此,迫切需要构建PRRSV易感的重组细胞系来解决这一瓶颈性问题。【目的】本论文拟借助CRISPR/Cas9技术对Marc145细胞的基因组进行修饰和改造,构建稳定表达猪源Sn（p Sn）的Marc145细胞株（p Sn-Marc145）,以期提高PRRSV的细胞吸附能力及其适应性和感染性,为PRRSV的基础与应用研究提供可靠的细胞平台支撑。【方法】本论文选择Marc145细胞第11号染色体RACGAP1和ASIC1基因之间的内含子序列作为打靶区域。首先,利用生物学软件设计单向导RNA（sg RNA）... 

【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省

【文章页数】：118 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Summary
缩略词表
第一章 CRISPR/ Cas9 技术在哺乳动物细胞中的应用
    1.1 CRISPR/ Cas9技术的研究进展
        1.1.1 CRISPR/ Cas9技术的发展历程
        1.1.2 CRISPR/ Cas分类
        1.1.3 CRISPR/ Cas9 技术及其作用的基本原理
        1.1.4 CRISPR/ Cas9 的基因修复路径
    1.2 CRISPR/ Cas9技术在生产病毒性疫苗哺乳动物细胞株的应用
        1.2.1 病毒性疫苗用哺乳动物细胞系的简介
        1.2.2 CRISPR/ Cas9技术在病毒性疫苗哺乳动物细胞的应用
第二章 猪源唾液黏附素受体研究进展
    1.1 Sn受体结构
    1.2 PRRSV与 Sn受体作用机理
        1.2.1 PRRSV流行现状
        1.2.2 PRRSV与 Sn受体的相互作用
        1.2.3 Sn受体与PRRSV的免疫作用机理
第三章 Marc145细胞基因组打靶位点的筛选及验证
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 细胞和载体
            1.1.2 仪器设备
            1.1.3 试剂
        1.2 方法
            1.2.1 打靶质粒构建
            1.2.2 eGFP供体质粒构建
            1.2.3 转染
            1.2.4 Surveyor核酸酶检测
            1.2.5 Junction PCR检测
            1.2.6 Southern Blotting检测
    2 结果
        2.1 Marc145 细胞基因组打靶位点的选择和sgRNA的设计及筛选
        2.2 打靶质粒和供体质粒的构建
        2.3 Cas9切割效率检测
        2.4 阳性细胞克隆鉴定
    3 讨论
    4 本章小结
第四章 不同Cas9在Marc145 细胞的切割效率及重组效率分析
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 打靶载体
            1.1.2 仪器设备
            1.1.3 试剂
        1.2 方法
            1.2.1 eSpCas9 打靶质粒构建
            1.2.2 Cas9n双打靶质粒构建
            1.2.3 pSpCas9、Cas9n（双打靶）和e Cas9 打靶质粒的转染
            1.2.4 Surveyor核酸酶检测三种打靶质粒的切割效率
            1.2.5 Junction PCR检测同源重组效率
    2 结果
        2.1 三种打靶质粒的构建
        2.2 三种打靶质粒的切割效率
        2.3 Junction PCR检测同源重组效率
    3 讨论
    4 本章小结
第五章 稳定表达猪源唾液酸黏附素Marc145细胞系的建立
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 载体
            1.1.2 仪器设备
            1.1.3 试剂
        1.2 方法
            1.2.1 嘌呤霉素浓度滴定
            1.2.2 猪源Sn供体质粒构建
            1.2.3 猪源Sn供体质粒与Cas9n（双sgRNA）质粒共转染
            1.2.4 压力筛选阳性克隆
            1.2.5 阳性细胞克隆鉴定
            1.2.6 pSn-Marc145 单克隆细胞的生物学特性分析
    2 结果
        2.1 猪源Sn供体质粒构建
        2.2 阳性细胞克隆鉴定
            2.2.1 Junction PCR结果
            2.2.2 Western Blotting结果
            2.2.3 间接免疫荧光检测结果
            2.2.4 Southern Blotting结果
        2.3 单克隆Marc145细胞生物学特性鉴定
            2.3.1 阳性克隆核型分析结果
            2.3.2 细胞形态观察及生长特性分析结果
    3 讨论
    4 本章小结
第六章 pSn-Marc145 细胞对PRRS疫苗毒株生物学特性的影响
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 细胞及PRRSV毒株
            1.1.2 仪器设备
            1.1.3 试剂
        1.2 方法
            1.2.1 病毒传代
            1.2.2 蚀斑形成试验
            1.2.3 间接免疫荧光
            1.2.4 病毒生长曲线
            1.2.5 Western Blotting
    2 结果
        2.1 不同PRRSV在 Marc145和pSn-Marc145 细胞的蚀斑表型
        2.2 间接免疫荧光检测结果
            2.2.1 VR2332
            2.2.2 CHIR
            2.2.3 JXA1
            2.2.4 R98
        2.3 病毒生长曲线的绘制结果
            2.3.1 VR2332
            2.3.2 CHIR
            2.3.3 JXA1
            2.3.4 R98
        2.4 Western Blotting结果
    3 讨论
    4 本章小结
第七章 PRRSV对 pSn-Marc145 细胞的感染性研究
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 细胞及PRRSV毒株
            1.1.2 仪器设备
            1.1.3 试剂
        1.2 方法
            1.2.1 病毒的传代培养
            1.2.2 PRRSV遗传变异分析
            1.2.3 实时荧光定量PCR
            1.2.4 蚀斑形成试验
            1.2.5 病毒生长曲线
    2 结果
        2.1 PRRSV传代培养
        2.2 PRRSV遗传变异分析结果
        2.3 实时荧光定量qPCR检测结果
        2.4 蚀斑形成试验结果
        2.5 病毒生长曲线检测结果
    3 讨论
    4 本章小结
全文结论
参考文献
致谢
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【参考文献】：
期刊论文
[1]A Novel DT40 Antibody Library for the Generation of Monoclonal Antibodies[J]. Bei Wang,Fei Wang,He Huang,Zhendong Zhao.  Virologica Sinica. 2019(06)
[2]Homologous recombination mediates stable Fah gene integration and phenotypic correction in tyrosinaemia mouse-model[J]. Norman Junge,Qinggong Yuan,Thu Huong Vu,Simon Krooss,Christien Bednarski,Asha Balakrishnan,Toni Cathomen,Michael P Manns,Ulrich Baumann,Amar Deep Sharma,Michael Ott.  World Journal of Hepatology. 2018(02)
[3]甲型肝炎减毒活疫苗病毒的水平传播[J]. 黄小琴,曹逸云,谭顺革,白惠珠,邵聪文,龙润乡,周德久,董德祥.  中华医学杂志. 2001(08)



本文编号：3157031