牛病毒性腹泻病毒p80蛋白单抗制备与表位鉴定及LJ36/14毒株的分离鉴定

发布时间：2021-04-24 08:41

　　牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）可引起牛病毒性腹泻/粘膜病（Bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD）。感染BVDV的牛临床症状表现为精神沉郁、采食量下降、大量流涎、腹泻、口腔黏膜充血溃疡,孕牛表现为流产或产出畸形胎儿或产出持续感染牛,新生犊牛因严重腹泻而死亡。目前BVDV在世界范围内流行,引起各个国家的高度关注。BVDV也是组织细胞培养及生物制品中最为常见的外源性病毒。根据BVDV 5’非编码区（5’UTR）的不同可以分为BVDV-1型和BVDV-2型两个基因型。不同基因型又进一步分为不同的基因亚型。根据接种细胞后能否产生细胞病变,BVDV分为致细胞病变型（CP）和非致细胞病变型（NCP）。若怀孕母牛感染NCP型BVDV后,会导致胎儿免疫耐受,胎儿或继续发育或流产,即使顺利产出也会成为持续感染（PI）牛,可持续向外界排毒,成为BVDV主要的传染源。而目前国内尚无商品化的检测试剂和相关疫苗。p80蛋白是BVDV非结构蛋白之一,在瘟病毒属中是一种突变率很低的非常保守的免疫优势蛋白,具有重要... 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：50 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 牛病毒性腹泻病毒概述
        1.1.1 牛病毒性腹泻病原的发现和分类
        1.1.2 病毒粒子的结构特征及理化性质
    1.2 BVDV分类及亚型
    1.3 流行病学
        1.3.1 BVDV的宿主和传染源
        1.3.2 BVDV的流行情况
    1.4 病毒基因组
    1.5 BVDV编码的蛋白及功能
    1.6 BVDV的检测
    1.7 BVDV的疫苗及防控
    1.8 研究目的和意义
第二章 牛病毒性腹泻病毒p80蛋白单克隆抗体的制备
    2.1 材料与方法
        2.1.1 细胞、毒株、质粒和实验动物
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 引物设计和目的基因的扩增
        2.1.4 重组质粒的构建
        2.1.5 p80蛋白的表达与纯化
        2.1.6 重组蛋白的Western blot分析
        2.1.7 小鼠的免疫
        2.1.8 饲养层的制备
        2.1.9 骨髓瘤（SP2/0）细胞的准备
        2.1.10 脾细胞的准备
        2.1.11 骨髓瘤（SP2/0）细胞和脾细胞的融合
        2.1.12 间接ELISA的建立
        2.1.13 阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆纯化
        2.1.14 MAb亚类的鉴定
        2.1.15 腹水制备及效价测定
        2.1.16 MAb的间接免疫荧光（IFA）鉴定
        2.1.17 MAb与猪瘟病毒交叉反应的间接免疫荧光检测（IFA）
    2.2 结果
        2.2.1 目的基因的扩增与pET30A-P80重组质粒的构建
        2.2.2 重组p80蛋白的表达与鉴定
        2.2.3 重组蛋白p80的纯化与Western blot分析
        2.2.4 杂交瘤细胞株的筛选、MAb亚类的鉴定及腹水效价的测定
        2.2.5 MAb间接免疫荧光检测
    2.3 讨论
第三章 p80蛋白抗原表位的鉴定
    3.1 材料与方法
        3.1.1 试剂与仪器
        3.1.2 p80蛋白截短表达方案
        3.1.3 pGEX-6P-1 表达载体的构建及截短蛋白的诱导表达
        3.1.4 诱导蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析
    3.2 SDS-PAGE和Western blot结果及分析
    3.3 讨论
第四章 牛病毒性腹泻病毒LJ36/14的分离与鉴定
    4.1 材料和方法
        4.1.1 实验材料及样品
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 样品处理与病毒分离
        4.1.4 分离株的RT-PCR检测及测序
        4.1.5 分离株的鉴定及其TCID50的测定
        4.1.6 分离株的分子进化分析
    4.2 结果
        4.2.1 病毒分离及RT-PCR检测结果
        4.2.2 分离株的免疫荧光鉴定
        4.2.3 分离株的分子进化树的构建
    4.3 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的表达与多克隆抗体制备[J]. 王雪枝,朱远茂,史鸿飞,严昊,蔡红,王姝,马磊,薛飞.  黑龙江畜牧兽医. 2014(05)
[2]牛病毒性腹泻病毒双单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用[J]. 杨俊兴,曹琛福,曾少灵,卢体康,孙洁,张彩虹,唐金明,陶虹,吕建强,花群义.  动物医学进展. 2013(05)
[3]福建龙岩规模化猪场BVDV感染的血清学调查[J]. 戴爱玲,魏春华,黄思琼,李晓华,杨小燕.  龙岩学院学报. 2013(02)
[4]牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定[J]. 王姝,朱远茂,蔡红,马磊,史鸿飞,吕闯,董秀梅,高欲燃,薛飞.  中国生物工程杂志. 2013(04)
[5]牛病毒性腹泻病毒夹心ELISA快速检测方法的建立与初步应用[J]. 李倬,马省强,陈文芳,石真真,平玲.  甘肃农业大学学报. 2012(03)
[6]猪瘟和蓝耳病疫苗中BVDV和PCV污染情况调查[J]. 叶兆美.  四川畜牧兽医. 2012(03)
[7]牛副流感病毒3型的分离鉴定及感染牛抗体消长规律的研究[J]. 周玉龙,吴海涛,任亚超,耿静,王密,谢金鑫,朴范泽.  中国人兽共患病学报. 2011(01)
[8]牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗原捕获ELISA检测方法的建立[J]. 张丽颖,刘畅,鲍永华,赵志辉.  畜牧与兽医. 2009(08)
[9]猪源牛病毒性腹泻病毒的流行初探[J]. 宋永峰,张志,张燕霞,吴发兴,李晓成.  中国动物检疫. 2008(07)
[10]牛病毒性腹泻病毒基因组结构与蛋白功能研究进展[J]. 范进江,薄新文,钟发刚.  动物医学进展. 2008(05)



本文编号：3157053