牛源抗金黄色葡萄球菌单链抗体的动物保护功能研究

发布时间：2021-04-25 08:30

　　引起奶牛乳腺炎的原因复杂多样,金黄色葡萄球菌是其中重要的病原之一。目前生产上针对金黄色葡萄球菌引发的奶牛乳腺炎的防治有抗生素、中草药以及灭活疫苗等,但是抗生素的过度使用会产生耐药性甚至“抗性奶”,危害公共卫生和人类身体健康,而中草药治疗用量大,成本高,灭活疫苗等预防效果也不理想。随着分子生物学和免疫学的发展,抗体制剂受到越来越多研究者的亲睐,尤其是小分子单链抗体,不仅保留了“Y”形抗体完整的抗原结合位点,且具有分子量小,免疫原性低,组织穿透能力强等优点,也备受大家关注。为探寻治疗奶牛乳腺炎的抗生素替代性生物制剂,本研究将其原核表达产物已显示具有一定治疗效果的8个针对牛源金黄色葡萄球菌单链抗体（scFv）的编码基因插入到pcDNA3.1（+）,构建真核表达质粒pcDNA3.1-scFv。首先验证单链抗体真核质粒的表达特性,将其注入小鼠乳腺内,经Western blot验证真核质粒从第1 d开始表达,第5 d达到表达高峰,在此基础上继续研究真核表达scFv对小鼠乳腺炎的治疗作用。具体方法是将混合的真核表达质粒经第四对乳腺导管注入到处于泌乳期的乳腺炎模型小鼠的乳腺中,以通过scFv在小鼠乳腺... 

【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 绪论
    1.1 奶牛乳腺炎的感染及发病机理
        1.1.1 奶牛乳腺炎的危害
        1.1.2 奶牛乳腺炎的病原
        1.1.3 奶牛乳腺炎的发病机理
    1.2 奶牛乳腺炎的诊断研究现状
    1.3 奶牛乳腺炎的防治研究进展
        1.3.1 抗生素治疗
        1.3.2 中草药治疗
        1.3.3 抗微生物制剂治疗
        1.3.4 加强日常管理
        1.3.5 目前防治奶牛乳腺炎方法的一些弊端
    1.4 单链抗体的研究进展
        1.4.1 scFv介绍
        1.4.2 scFv的噬菌体展示
        1.4.3 scFv的真核表达
        1.4.4 scFv的应用
    1.5 本实验室研究基础
    1.6 本论文研究的目的及意义
第二章 牛源抗金黄色葡萄球菌SCFV真核质粒的构建及其在小鼠乳腺内的表达时效研究
    2.1 材料
        2.1.1 菌种和质粒
        2.1.2 实验动物
        2.1.3 主要试剂与仪器
    2.2 实验动物的分组和处理
    2.3 实验方法
        2.3.1 scFv的引物设计
        2.3.2 PCR扩增目的基因
        2.3.3 目的基因与pMD-18-T连接
        2.3.4 转化
        2.3.5 质粒提取
        2.3.6 pMD-18-T-scFv质粒双酶切鉴定
        2.3.7 重组真核质粒（pcDNA3.1-scFv）的构建
        2.3.8 pET-28a-scFv的原核表达蛋白的诱导
        2.3.9 蛋白的分离、纯化
        2.3.10 兔抗牛源scFv多克隆抗体制备
        2.3.11 兔抗牛源scFv多克隆抗体ELISA效价测定
        2.3.12 pcDNA3.1-scFv重组质粒的无内毒素提取
        2.3.13 Western-blot验证重组质粒在小鼠乳腺内的表达时效
    2.4 结果
        2.4.1 pcDNA3.1-scFv重组质粒的构建及鉴定
        2.4.2 pcDNA3.1-scFv真核重组质粒在小鼠乳腺内的表达时效
    2.5 讨论
    2.6 本章小结
第三章 牛源抗金黄色葡萄球菌单链抗体防治小鼠乳腺炎的研究
    3.1 材料
        3.1.1 菌株和质粒
        3.1.2 主要试剂与仪器
        3.1.3 实验动物
    3.2 实验动物的分组和处理
        3.2.1 pcDNA3.1-scFv真核表达质粒针对小鼠乳腺炎的预防研究
        3.2.2 pcDNA3.1-scFv真核表达质粒针对小鼠乳腺炎的治疗研究
    3.3 实验方法
        3.3.1 乳腺组织细菌计数
        3.3.2 乳腺组织病理切片
        3.3.3 小鼠的乳腺组织细胞因子检测（TNF-α、IL6和IL17）
    3.4 结果
        3.4.1 pcDNA3.1-scFv真核表达质粒针对小鼠乳腺炎的预防研究结果
        3.4.2 pcDNA3.1-scFv真核表达质粒针对小鼠乳腺炎的治疗研究结果
    3.5 讨论
    3.6 本章小结
第四章 牛源抗金黄色葡萄球菌SCFV针对奶牛隐性乳腺炎的治疗研究
    4.1 材料
        4.1.1 质粒
        4.1.2 主要试剂与仪器
    4.2 实验动物及分组
    4.3 实验方法
        4.3.1 奶样细菌计数
        4.3.2 CMT检测和效果判定标准
        4.3.3 生物安全性评价
        4.3.4 乳样、尿样和粪样基因组的提取
    4.4 结果
        4.4.1 奶样细菌计数结果
        4.4.2 奶样CMT检测结果
        4.4.3 生物安全性评价结果
    4.5 讨论
    4.6 本章小结
第五章 全文结论
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间已发表或录用的论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]奶牛乳房炎的危害及防治[J]. 崔利华,蒋作吉,李静溪,吕红庆.  新疆畜牧业. 2017(06)
[2]奶牛乳腺炎的临床症状、诊断方法及防治措施[J]. 王彦涛.  现代畜牧科技. 2017(06)
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[4]奶牛乳房炎防治技术指南(试行)[J].   广东奶业. 2010(04)
[5]阿莫西林纳米粒对奶牛乳房炎主要病原菌的体外PAE[J]. 杨雪峰,欧阳五庆,孙江才,李向辉.  西北农林科技大学学报(自然科学版). 2009(06)
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[7]上海地区奶牛乳房炎主要病原菌的分离鉴定及耐药性分析[J]. 易明梅,黄奕倩,朱建国,孙怀昌,华修国,袁耀明,王赞江.  中国兽医学报. 2009(03)
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[9]人溶菌酶cDNA在COS-1细胞及小鼠乳腺的暂态表达[J]. 李国才,张泉,黄永生,薛方明,陈兵,孙怀昌,李厚达.  中国生物制品学杂志. 2005(05)
[10]奶牛乳房炎类型与病原菌感染之间相关性的研究[J]. 李宏胜,郁杰,李新圃,罗金印,徐继英,张礼华,潘虎,张志常,袁永隆,杨玉英,刘纯传,侯奕昭.  动物医学进展. 2004(06)

博士论文
[1]蒲公英甾醇对LPS诱导的乳腺炎抗炎作用及调节机制研究[D]. 伞治豪.吉林大学 2014
[2]乳腺炎细胞因子及T淋巴细胞亚群研究[D]. 敬晓棋.西北农林科技大学 2013
[3]甘草总黄酮抗金黄色葡萄球菌作用及其治疗奶牛乳房炎的应用研究[D]. 吴金梅.吉林大学 2012

硕士论文
[1]Th17/IL-17在金黄色葡萄球菌小鼠乳腺感染模型中的动态变化及功能初探[D]. 刘秉春.内蒙古大学 2013
[2]抗奶牛乳腺炎特异性IgY的制备及活性研究[D]. 王宇.大连理工大学 2006



本文编号：3159061