羊口疮病毒的分离鉴定与B2L和F1L基因在昆虫杆状病毒系统中的表达及免疫原性分析
发布时间：2021-04-25 13:11
羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）又称接触传染性脓疱皮炎病毒（Contagious pustular dermatitis virus,CPDV）,主要引起绵羊和山羊的急性脓疱性皮肤病,且可感染人。为了研究陕北白绒山羊羊群中流行ORFV的生物学特性及流行特征,在某白绒山羊场采集具有典型羊口疮症状的病羊结痂病料,用MDBK进行病毒分离培养。同时用特异性引物对ORFV的B2L和F1L基因全长进行扩增,并从核苷酸和氨基酸水平上对其同源性进行分析,同时对分离的毒株进行遗传进化分析。基于杆状病毒表达系统,对ORFV的B2L、F1L和B2L-F1L分别进行真核表达,并通过SDS-PAGE、质谱以及Western blot等方法进行鉴定,利用纯化的重组蛋白建立ORFV的间接ELISA检测方法,并检测重组蛋白的免疫保护性,为羊口疮病的防控提供了新思路。1.将疑似病料处理液在MDBK细胞上盲传至5代后,可见产生明显的CPE,经PCR鉴定成功分离到了ORFV,将其命名为ORFV-Yulin。2.扩增的B2L基因和F1L基因大小分别为1 137 bp和1 029 bp。基于B2L基因核苷酸序列的遗传...
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：93 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
1.1 流行病学
1.2 病原学
1.2.1 病毒分类
1.2.2 ORFV基因结构
1.2.3 病毒结构
1.2.4 ORFV引起的免疫反应
1.2.5 抑制细胞凋亡
1.2.6 抑制NF-κB信号通路
1.2.7 抑制干扰素通路
1.2.8 抑制免疫细胞的迁移
1.2.9 病毒的主要蛋白及功能
1.3 羊口疮疫苗的研制进展
1.4 研究背景和意义
1.4.1 研究背景
1.4.2 研究目的和意义
1.5 技术路线
2 试验一 羊口疮病毒的分离鉴定及遗传进化分析
2.1 材料方法
2.1.1 流行病学调查
2.1.2 病料
2.1.3 载体、菌株与主要试剂
2.1.4 配制的实验溶液
2.1.5 引物设计
2.1.6 病毒分离
2.1.7 B2L全长基因的扩增
2.1.8 F1L全长基因的扩增
2.1.9 B2L与F1L基因的克隆
2.1.10 序列比对
2.2 结果
2.2.1 流行情况调查
2.2.2 病羊临床症状
2.2.3 病毒分离
2.2.4 分离毒株的B2L全长基因的克隆
2.2.5 分离毒株ORFV毒株B2L基因遗传进化分析
2.2.6 分离毒株的F1L基因全长的克隆
2.2.7 分离毒株ORFV毒株F1L基因遗传进化分析
2.3 讨论
2.4 小结
3 试验二 羊口疮病毒B2L和F1L基因在昆虫杆状病毒中的表达
3.1 材料方法
3.1.1 载体、菌株与主要试剂
3.1.2 配制的实验溶液
3.1.3 引物设计
3.1.4 带有酶切位点B2L基因的扩增
3.1.5 B2L PCR产物的回收和纯化
3.1.6 杆状病毒表达载体的构建
3.1.7 B2L在昆虫杆状病毒表达系统的表达鉴定
3.1.8 带有酶切位点不含有信号肽的F1L基因（cF1L）的扩增
3.1.9 cF1L PCR产物的回收和纯化
3.1.10 杆状病毒表达载体的构建
3.2 结果
3.2.1 B2L基因昆虫杆状病毒表达重组质粒的构建
3.2.2 表达B2L杆状病毒的包装与收获
3.2.3 B2L蛋白在sf9细胞中的表达鉴定
3.2.4 重组F1L基因（cF1L）的成功扩增
3.2.5 pBac-cF1L载体的构建以及酶切鉴定结果
3.2.6 cF1L基因的表达与鉴定
3.3 讨论
3.4 小结
4 试验三 羊口疮病毒B2L和F1L基因在昆虫杆状病毒系统中的串联表达
4.1 材料方法
4.1.1 载体、菌株与主要试剂
4.1.2 配制的实验溶液
4.1.3 引物设计
4.1.4 融合基因GB2LcF1L的PCR扩增与pGT-GB2LcF1L的构建
4.1.5 GB2LcF1L在昆虫杆状病毒表达系统中表达
4.2 结果
4.2.1 rB2L融合基因的扩增
4.2.2 GB2LcF1L融合基因的扩增
4.2.3 pBac-GB2LcF1L载体的鉴定
4.2.4 rB2LcF1L串联蛋白在昆虫杆状病毒表达系统的表达
4.3 讨论
4.4 小结
5 实验四B2L和F1L融合蛋白的抗原性研究
5.1 材料方法
5.1.1 载体、菌株、主要试剂与实验动物
5.1.2 配制的实验溶液
5.1.3 rB2LcF1L蛋白的纯化及定量
5.1.4 羊口疮病毒抗血清的制备
5.1.5 rB2LcF1L与抗羊口疮病毒血清反应的Western blot检测
5.1.6 间接ELISA方法的建立以及应用
5.1.7 rB2LcF1L蛋白的免疫保护
5.2 结果
5.2.1 rB2LcF1L蛋白的纯化
5.2.2 rB2LcF1L串联蛋白与抗羊口疮病毒阳性血清的反应
5.2.3 间接ELISA最佳工作条件的确定
5.2.4 特异性试验
5.2.5 敏感性试验
5.2.6 重复性试验
5.2.7 临床样本检测
5.3 讨论
5.4 小结
6 结论
7 创新点
8 展望
致谢
参考文献
作者简介
附录
【参考文献】：
期刊论文
[1]羊口疮病毒F1L、B2L基因重组腺病毒构建及对小鼠的免疫效果分析[J]. 陈晓,葛雷,戴建军,李丽,张德福,吴彩凤,张树山. 畜牧兽医学报. 2018(08)
[2]羊口疮病毒单抗可变区氨基酸序列及同源建模分析[J]. 张雪,谭强,赵文博,段旭阳,冯振月,马金柱,崔玉东,于永忠. 中国兽医学报. 2018(05)
[3]羊口疮病毒B2L基因DNA疫苗的构建及其诱导的免疫应答[J]. 李鹏飞,冯将,鲜思美,刘嫒,李婷,包细明,张益,张素辉. 中国兽医学报. 2018(04)
[4]羊口疮病毒F1L基因真核表达质粒构建及对小鼠的免疫原性[J]. 李鹏飞,冯将,刘嫒,李婷,包细明,张益,鲜思美. 中国兽医学报. 2018(02)
[5]羊IL-2基因和羊口疮病毒B2L基因真核表达重组质粒联合免疫小鼠的效果评价[J]. 鲜思美,李鹏飞,冯将,刘嫒,李婷,包细明,张益,张素辉. 中国预防兽医学报. 2017(08)
[6]江苏省羊口疮病毒的分离鉴定及B2L基因的遗传进化分析[J]. 王秋霞,朱相儒,易成功,秦涛,陈素娟,彭大新,夏同海. 中国畜牧兽医. 2017(04)
[7]羊口疮病毒湖北株B2L基因的克隆与遗传进化分析[J]. 郭锐,田永祥,周丹娜,段正赢,杨克礼,刘泽文,袁芳艳,刘威. 中国兽医杂志. 2017(02)
[8]口疮病毒B2L蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立[J]. 庞文静,张琪,郭抗抗,何亚鹏,付明哲,许信刚. 中国兽医科学. 2017(02)
[9]Diagnosis and phylogenetic analysis of orf virus in Aleppo and Saanen goats from an outbreak in Turkey[J]. Zeynep Akkutay-Yoldar,Tuba Cigdem Oguzoglu,Y?lmaz Ak?a. Virologica Sinica. 2016(03)
[10]抗羊口疮病毒ORFV118蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及其应用[J]. 肖斌,郝文波,杜政伦,廖小青,罗树红. 病毒学报. 2016(03)
博士论文
[1]羊传染性脓疱病毒FIL基因克隆表达及分子生物学检测方法的建立与初步应用[D]. 邵洪泽.吉林农业大学 2013
[2]羊传染性脓疱病毒重组DNA疫苗的构建与实验免疫研究[D]. 赵魁.吉林大学 2010
硕士论文
[1]青岛奥特奶山羊养殖场羊口疮病原学调查及灭活疫苗免疫效果评估[D]. 李星明.西北农林科技大学 2018
[2]羊口疮抗体间接ELISA方法的建立及血清学调查[D]. 王斌.湖南农业大学 2017
[3]羊口疮病毒陕西株B2L基因的克隆表达及间接ELISA检测方法的建立[D]. 何建斌.西北农林科技大学 2017
[4]羊口疮病毒B2L和F1L基因的表达及其多克隆抗体的制备[D]. 李国华.海南大学 2017
[5]陕西白绒山羊和奶山羊羊口疮病原调查及灭活疫苗免疫效果评估[D]. 李雯丽.西北农林科技大学 2016
[6]羊口疮病毒和山羊痘病毒的分离鉴定及羊口疮病毒B2L蛋白单克隆抗体的研制[D]. 朱相儒.扬州大学 2016
[7]羊口疮抗体ELISA检测方法的建立及应用[D]. 李杰.西北农林科技大学 2013
[8]羊口疮病毒的分离鉴定及其ELISA检测方法的建立[D]. 张海瑞.中国农业科学院 2011
本文编号：3159447
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：93 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
1.1 流行病学
1.2 病原学
1.2.1 病毒分类
1.2.2 ORFV基因结构
1.2.3 病毒结构
1.2.4 ORFV引起的免疫反应
1.2.5 抑制细胞凋亡
1.2.6 抑制NF-κB信号通路
1.2.7 抑制干扰素通路
1.2.8 抑制免疫细胞的迁移
1.2.9 病毒的主要蛋白及功能
1.3 羊口疮疫苗的研制进展
1.4 研究背景和意义
1.4.1 研究背景
1.4.2 研究目的和意义
1.5 技术路线
2 试验一 羊口疮病毒的分离鉴定及遗传进化分析
2.1 材料方法
2.1.1 流行病学调查
2.1.2 病料
2.1.3 载体、菌株与主要试剂
2.1.4 配制的实验溶液
2.1.5 引物设计
2.1.6 病毒分离
2.1.7 B2L全长基因的扩增
2.1.8 F1L全长基因的扩增
2.1.9 B2L与F1L基因的克隆
2.1.10 序列比对
2.2 结果
2.2.1 流行情况调查
2.2.2 病羊临床症状
2.2.3 病毒分离
2.2.4 分离毒株的B2L全长基因的克隆
2.2.5 分离毒株ORFV毒株B2L基因遗传进化分析
2.2.6 分离毒株的F1L基因全长的克隆
2.2.7 分离毒株ORFV毒株F1L基因遗传进化分析
2.3 讨论
2.4 小结
3 试验二 羊口疮病毒B2L和F1L基因在昆虫杆状病毒中的表达
3.1 材料方法
3.1.1 载体、菌株与主要试剂
3.1.2 配制的实验溶液
3.1.3 引物设计
3.1.4 带有酶切位点B2L基因的扩增
3.1.5 B2L PCR产物的回收和纯化
3.1.6 杆状病毒表达载体的构建
3.1.7 B2L在昆虫杆状病毒表达系统的表达鉴定
3.1.8 带有酶切位点不含有信号肽的F1L基因（cF1L）的扩增
3.1.9 cF1L PCR产物的回收和纯化
3.1.10 杆状病毒表达载体的构建
3.2 结果
3.2.1 B2L基因昆虫杆状病毒表达重组质粒的构建
3.2.2 表达B2L杆状病毒的包装与收获
3.2.3 B2L蛋白在sf9细胞中的表达鉴定
3.2.4 重组F1L基因（cF1L）的成功扩增
3.2.5 pBac-cF1L载体的构建以及酶切鉴定结果
3.2.6 cF1L基因的表达与鉴定
3.3 讨论
3.4 小结
4 试验三 羊口疮病毒B2L和F1L基因在昆虫杆状病毒系统中的串联表达
4.1 材料方法
4.1.1 载体、菌株与主要试剂
4.1.2 配制的实验溶液
4.1.3 引物设计
4.1.4 融合基因GB2LcF1L的PCR扩增与pGT-GB2LcF1L的构建
4.1.5 GB2LcF1L在昆虫杆状病毒表达系统中表达
4.2 结果
4.2.1 rB2L融合基因的扩增
4.2.2 GB2LcF1L融合基因的扩增
4.2.3 pBac-GB2LcF1L载体的鉴定
4.2.4 rB2LcF1L串联蛋白在昆虫杆状病毒表达系统的表达
4.3 讨论
4.4 小结
5 实验四B2L和F1L融合蛋白的抗原性研究
5.1 材料方法
5.1.1 载体、菌株、主要试剂与实验动物
5.1.2 配制的实验溶液
5.1.3 rB2LcF1L蛋白的纯化及定量
5.1.4 羊口疮病毒抗血清的制备
5.1.5 rB2LcF1L与抗羊口疮病毒血清反应的Western blot检测
5.1.6 间接ELISA方法的建立以及应用
5.1.7 rB2LcF1L蛋白的免疫保护
5.2 结果
5.2.1 rB2LcF1L蛋白的纯化
5.2.2 rB2LcF1L串联蛋白与抗羊口疮病毒阳性血清的反应
5.2.3 间接ELISA最佳工作条件的确定
5.2.4 特异性试验
5.2.5 敏感性试验
5.2.6 重复性试验
5.2.7 临床样本检测
5.3 讨论
5.4 小结
6 结论
7 创新点
8 展望
致谢
参考文献
作者简介
附录
【参考文献】：
期刊论文
[1]羊口疮病毒F1L、B2L基因重组腺病毒构建及对小鼠的免疫效果分析[J]. 陈晓,葛雷,戴建军,李丽,张德福,吴彩凤,张树山. 畜牧兽医学报. 2018(08)
[2]羊口疮病毒单抗可变区氨基酸序列及同源建模分析[J]. 张雪,谭强,赵文博,段旭阳,冯振月,马金柱,崔玉东,于永忠. 中国兽医学报. 2018(05)
[3]羊口疮病毒B2L基因DNA疫苗的构建及其诱导的免疫应答[J]. 李鹏飞,冯将,鲜思美,刘嫒,李婷,包细明,张益,张素辉. 中国兽医学报. 2018(04)
[4]羊口疮病毒F1L基因真核表达质粒构建及对小鼠的免疫原性[J]. 李鹏飞,冯将,刘嫒,李婷,包细明,张益,鲜思美. 中国兽医学报. 2018(02)
[5]羊IL-2基因和羊口疮病毒B2L基因真核表达重组质粒联合免疫小鼠的效果评价[J]. 鲜思美,李鹏飞,冯将,刘嫒,李婷,包细明,张益,张素辉. 中国预防兽医学报. 2017(08)
[6]江苏省羊口疮病毒的分离鉴定及B2L基因的遗传进化分析[J]. 王秋霞,朱相儒,易成功,秦涛,陈素娟,彭大新,夏同海. 中国畜牧兽医. 2017(04)
[7]羊口疮病毒湖北株B2L基因的克隆与遗传进化分析[J]. 郭锐,田永祥,周丹娜,段正赢,杨克礼,刘泽文,袁芳艳,刘威. 中国兽医杂志. 2017(02)
[8]口疮病毒B2L蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立[J]. 庞文静,张琪,郭抗抗,何亚鹏,付明哲,许信刚. 中国兽医科学. 2017(02)
[9]Diagnosis and phylogenetic analysis of orf virus in Aleppo and Saanen goats from an outbreak in Turkey[J]. Zeynep Akkutay-Yoldar,Tuba Cigdem Oguzoglu,Y?lmaz Ak?a. Virologica Sinica. 2016(03)
[10]抗羊口疮病毒ORFV118蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及其应用[J]. 肖斌,郝文波,杜政伦,廖小青,罗树红. 病毒学报. 2016(03)
博士论文
[1]羊传染性脓疱病毒FIL基因克隆表达及分子生物学检测方法的建立与初步应用[D]. 邵洪泽.吉林农业大学 2013
[2]羊传染性脓疱病毒重组DNA疫苗的构建与实验免疫研究[D]. 赵魁.吉林大学 2010
硕士论文
[1]青岛奥特奶山羊养殖场羊口疮病原学调查及灭活疫苗免疫效果评估[D]. 李星明.西北农林科技大学 2018
[2]羊口疮抗体间接ELISA方法的建立及血清学调查[D]. 王斌.湖南农业大学 2017
[3]羊口疮病毒陕西株B2L基因的克隆表达及间接ELISA检测方法的建立[D]. 何建斌.西北农林科技大学 2017
[4]羊口疮病毒B2L和F1L基因的表达及其多克隆抗体的制备[D]. 李国华.海南大学 2017
[5]陕西白绒山羊和奶山羊羊口疮病原调查及灭活疫苗免疫效果评估[D]. 李雯丽.西北农林科技大学 2016
[6]羊口疮病毒和山羊痘病毒的分离鉴定及羊口疮病毒B2L蛋白单克隆抗体的研制[D]. 朱相儒.扬州大学 2016
[7]羊口疮抗体ELISA检测方法的建立及应用[D]. 李杰.西北农林科技大学 2013
[8]羊口疮病毒的分离鉴定及其ELISA检测方法的建立[D]. 张海瑞.中国农业科学院 2011
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