酵母双杂交系统筛选猪流行性腹泻病毒N蛋白互作宿主蛋白及N蛋白抗原表位鉴定
发布时间：2021-04-26 05:47
猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）感染猪小肠细胞致使细胞死亡脱落从而引起的急性传染病,主要临床症状是水样腹泻、呕吐,对7日龄以内哺乳仔猪尤为易感。自2010年以来,以变异PEDV为主要病原体的PED在我国爆发,并迅速席卷全国及周边亚洲国家,给养猪业带来巨大的经济损失。PEDV为典型的单股正链RNA冠状病毒,与其他冠状病毒一样具有四个结构蛋白分别为纤突（Spike,S）蛋白、膜（Membrane,M）蛋白、小膜蛋白（Envelope,E）和核衣壳（Nucleocapsid,N）,其中N蛋白是一个重要的结构蛋白,并且高度保守,因此筛选PEDV N蛋白与宿主细胞的互作蛋白,以及筛选针对N蛋白抗原表位,对于探寻PEDV的致病机制和特异性新型疫苗研究等提供帮助。本实验研究内容及结果如下:（1）为了获得与PEDV N蛋白相互作用的宿主蛋白。本研究构建猪流行性腹泻病毒N蛋白基因的重组载体p GBKT7-N,以其作为诱饵质粒,采用酵母双杂交方法,经过两次缺失培养基筛选...
【文章来源】：河南科技大学河南省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 文献综述
1.1 PEDV概述
1.1.1 PEDV的危害
1.1.2 PEDV致病机理
1.1.3 PEDV分子结构特征及结构蛋白功能
1.1.4 PEDV细胞培养
1.1.5 PEDV的诊断
1.1.6 亚洲地区PEDV疫苗的研究
1.2 酵母双杂交技术概述
1.2.1 酵母双杂交技术的原理
1.2.2 酵母双杂交技术的优势
1.2.3 酵母双杂交技术的局限性
1.2.4 酵母双杂交技术的延伸
1.3 研究目的和意义
第2章 诱饵载体pGBKT7-N的构建和其毒性、自激活效应检测
2.1 前言
2.2 材料
2.2.1 菌株和质粒
2.2.2 试剂
2.2.3 培养基及试剂配制
2.2.4 仪器设备
2.3 方法
2.3.1 诱饵载体pGBKT7-N的构建
2.3.2 重组质粒pGBKT7-N转化Y2H Gold感受态
2.3.3 重组质粒pGBKT7-N对酵母细胞毒性以及自激活性的检测
2.4 结果
2.4.1 PCR扩增N目的基因
2.4.2 诱饵质粒pGBKT7-N的菌液PCR鉴定
2.4.3 诱饵蛋白自激活与毒性检测
2.5 讨论
第3章 酵母双杂交法筛选与PEDV N蛋白相互作用的蛋白
3.1 前言
3.2 材料
3.2.1 菌株和质粒
3.2.2 试剂
3.2.3 培养基及配制
3.2.4 仪器设备
3.3 方法
3.3.1 pGBKT7-N质粒转化Y2H Gold酵母感受态细胞
3.3.2 pGBKT7-N重组Y2H Gold酵母菌与猪肺泡巨噬细胞文库酵母菌融合
3.3.3 酵母双杂交筛选PEDV N蛋白互作的宿主蛋白
3.3.4 LGALS3和SNRPG蛋白回返实验和自激活实验
3.3.5 Co-IP验证PEDV N蛋白与LGALS3、SNRPG的相互作用
3.4 结果
3.4.1 pGBKT7-N质粒转化Y2H Gold酵母感受态细胞
3.4.2 酵母双杂交筛选阳性菌
3.4.3 酵母双杂交筛选PEDV N蛋白互作的宿主蛋白
3.4.4 回返和自激活实验验证N蛋白与LGALS3、SNRPG的相互作用
3.4.5 Co-IP验证PEDV N蛋白与LGALS3、SNRPG的相互作用
3.5 讨论
第4章 PEDV N蛋白抗原表位鉴定
4.1 前言
4.2 材料
4.2.1 菌种、质粒和细胞
4.2.2 主要试剂及试剂盒
4.2.3 仪器设备
4.3 方法
4.3.1 N蛋白单克隆抗体腹水制备
4.3.2 N区域表位鉴定
4.3.3 N1-N2区域表位鉴定
4.4 结果
4.4.1 N蛋白单克隆抗体腹水制备
4.4.2 N区分段表位鉴定
4.4.3 N1-N2区分段表位鉴定
4.5 讨论
第5章 结论
参考文献
缩略语词汇表
附录Ⅰ OMEGA Gel Extraction Kit具体步骤
附录Ⅱ OMEGA Gel Extraction Kit具体步骤
附录Ⅲ Western blot实验步骤
附录Ⅳ 质粒转化酵母感受态细胞步骤
致谢
攻读学位期间的研究成果
本文编号：3160852
【文章来源】：河南科技大学河南省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 文献综述
1.1 PEDV概述
1.1.1 PEDV的危害
1.1.2 PEDV致病机理
1.1.3 PEDV分子结构特征及结构蛋白功能
1.1.4 PEDV细胞培养
1.1.5 PEDV的诊断
1.1.6 亚洲地区PEDV疫苗的研究
1.2 酵母双杂交技术概述
1.2.1 酵母双杂交技术的原理
1.2.2 酵母双杂交技术的优势
1.2.3 酵母双杂交技术的局限性
1.2.4 酵母双杂交技术的延伸
1.3 研究目的和意义
第2章 诱饵载体pGBKT7-N的构建和其毒性、自激活效应检测
2.1 前言
2.2 材料
2.2.1 菌株和质粒
2.2.2 试剂
2.2.3 培养基及试剂配制
2.2.4 仪器设备
2.3 方法
2.3.1 诱饵载体pGBKT7-N的构建
2.3.2 重组质粒pGBKT7-N转化Y2H Gold感受态
2.3.3 重组质粒pGBKT7-N对酵母细胞毒性以及自激活性的检测
2.4 结果
2.4.1 PCR扩增N目的基因
2.4.2 诱饵质粒pGBKT7-N的菌液PCR鉴定
2.4.3 诱饵蛋白自激活与毒性检测
2.5 讨论
第3章 酵母双杂交法筛选与PEDV N蛋白相互作用的蛋白
3.1 前言
3.2 材料
3.2.1 菌株和质粒
3.2.2 试剂
3.2.3 培养基及配制
3.2.4 仪器设备
3.3 方法
3.3.1 pGBKT7-N质粒转化Y2H Gold酵母感受态细胞
3.3.2 pGBKT7-N重组Y2H Gold酵母菌与猪肺泡巨噬细胞文库酵母菌融合
3.3.3 酵母双杂交筛选PEDV N蛋白互作的宿主蛋白
3.3.4 LGALS3和SNRPG蛋白回返实验和自激活实验
3.3.5 Co-IP验证PEDV N蛋白与LGALS3、SNRPG的相互作用
3.4 结果
3.4.1 pGBKT7-N质粒转化Y2H Gold酵母感受态细胞
3.4.2 酵母双杂交筛选阳性菌
3.4.3 酵母双杂交筛选PEDV N蛋白互作的宿主蛋白
3.4.4 回返和自激活实验验证N蛋白与LGALS3、SNRPG的相互作用
3.4.5 Co-IP验证PEDV N蛋白与LGALS3、SNRPG的相互作用
3.5 讨论
第4章 PEDV N蛋白抗原表位鉴定
4.1 前言
4.2 材料
4.2.1 菌种、质粒和细胞
4.2.2 主要试剂及试剂盒
4.2.3 仪器设备
4.3 方法
4.3.1 N蛋白单克隆抗体腹水制备
4.3.2 N区域表位鉴定
4.3.3 N1-N2区域表位鉴定
4.4 结果
4.4.1 N蛋白单克隆抗体腹水制备
4.4.2 N区分段表位鉴定
4.4.3 N1-N2区分段表位鉴定
4.5 讨论
第5章 结论
参考文献
缩略语词汇表
附录Ⅰ OMEGA Gel Extraction Kit具体步骤
附录Ⅱ OMEGA Gel Extraction Kit具体步骤
附录Ⅲ Western blot实验步骤
附录Ⅳ 质粒转化酵母感受态细胞步骤
致谢
攻读学位期间的研究成果
本文编号：3160852
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