猪O型口蹄疫病毒VP0、VP1、VP3蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立
发布时间：2021-04-26 08:41
口蹄疫（foot-and-mouth disease, FMD）严重地影响着世界各国畜牧业的发展，目前对该病的控制，主要采取诊断检测与疫苗免疫相结合的方法。在FMD的诊断技术中，最有效、最经济的方法是酶联免疫吸附试验（ELISA）。传统的ELISA方法是以全病毒作为抗原检测血清抗体，但在全病毒的生产过程中存在着病毒扩散的危险，因此，将口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）结构蛋白基因进行体外表达，将纯化的蛋白作为检测方法的抗原是一种更安全、更有效的方法。另外，将纯化的蛋白免疫动物，诱导动物机体产生抗体，可用于疫苗的研制，为FMD亚单位疫苗的研制奠定了基础。本研究根据GenBank数据库中公布的猪O型FMDV基因序列（JN998085.1）合成了FMDV结构蛋白前体蛋白P1基因。以上海生工生物工程股份有限公司合成的pUC57-P1质粒为模板，扩增得到了VP0、VP1、VP3基因，利用SUMO融合表达载体在大肠埃希氏菌BL21（DE3） plysS中表达，分别获得了45ku、35ku和35ku的融合蛋白SUMO-VP0、SUMO-VP1及SUMO-...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 口蹄疫
1.1.1 口蹄疫的危害及流行现状
1.1.2 口蹄疫病原特征
1.1.3 O 型口蹄疫病毒抗原位点研究进展
1.2 口蹄疫诊断技术研究进展
1.2.1 临床诊断
1.2.2 生物学诊断技术
1.2.3 血清学诊断
1.2.4 分子生物学技术
1.2.5 其他方法
1.3 本研究的目的及意义
第二章 猪 O 型口蹄疫病毒结构蛋白基因 VP0、VP1、VP3的克隆及表达载体的构建
2.1 材料
2.1.1 病毒基因、菌株与载体
2.1.2 主要试剂及酶
2.1.3 主要仪器
2.2 方法
2.2.1 病毒基因合成
2.2.2 引物的设计与合成
2.2.3 VP0、VP1、VP3 基因片段的 PCR 扩增
2.2.4 VP0、VP1、VP3 基因 PCR 产物的回收
2.2.5 VP0、VP1、VP3 基因的克隆
2.2.6 感受态细胞的制备
2.2.7 重组质粒转化 E.coli DH5
2.2.8 重组质粒的提取
2.2.9 重组质粒的 PCR 鉴定
2.2.10 重组质粒的双酶切鉴定
2.2.11 重组质粒的测序鉴定
2.2.12 原核表达质粒的构建
2.2.13 连接产物转化 E.coli DH5
2.2.14 原核表达质粒的提取
2.2.15 原核表达质粒的 PCR 鉴定
2.2.16 原核表达质粒的双酶切鉴定
2.2.17 原核表达质粒的测序鉴定
2.2.18 原核表达质粒转化 BL21（DE3）plysS
2.2.19 原核表达质粒的提取及鉴定
2.3 结果
2.3.1 VP0、VP1、VP3 基因的扩增
2.3.2 重组质粒的 PCR 鉴定
2.3.3 重组质粒的双酶切鉴定
2.3.4 重组质粒的测序鉴定
2.3.5 原核表达质粒的 PCR 鉴定
2.3.6 原核表达质粒的双酶切鉴定
2.3.7 原核表达质粒的测序鉴定
2.4 讨论
第三章 猪 O 型口蹄疫病毒结构蛋白的原核表达及可溶性表达条件的摸索
3.1 材料
3.1.1 主要试剂及酶
3.1.2 主要仪器
3.2 方法
3.2.1 原核表达质粒在大肠杆菌中的诱导表达
3.2.2 SDS-PAGE 分析
3.2.3 Western blot 分析
3.2.4 目的蛋白大量表达的预处理
3.2.5 目的蛋白可溶性表达条件的摸索
3.3 结果
3.3.1 SDS-PAGE 分析结果
3.3.2 Western blot 分析结果
3.3.3 目的蛋白大量表达的预处理结果
3.3.4 目的蛋白可溶性表达条件的摸索
3.4 讨论
第四章 SUMO-VP0、SUMO-VP1、SUMO-VP3 及 VP3 蛋白的纯化
4.1 材料
4.1.1 主要试剂及酶
4.1.2 主要仪器
4.2 方法
4.2.1 透析袋的处理及保存
4.2.2 蛋白的重折叠处理
4.2.3 通过 BCA 蛋白定量分析法测定样品中蛋白含量
4.2.4 蛋白的纯化
4.2.5 蛋白的浓缩
4.2.6 测定浓缩后蛋白样品中蛋白含量
4.3 结果
4.3.1 纯化产物的 SDS-PAGE 分析
4.3.2 VP3 蛋白的特异性分析
4.4 讨论
第五章 SUMO-VP0、SUMO-VP1、SUMO-VP3 及 VP3 蛋白间接 ELISA 方法的建立
5.1 材料
5.1.1 主要试剂及酶
5.1.2 主要仪器
5.2 方法
5.2.1 方阵滴定法确定蛋白最佳包被浓度及血清最佳稀释度
5.2.2 最佳抗原包被条件的确定
5.2.3 最佳封闭液的确定
5.2.4 最佳封闭条件的确定
5.2.5 最佳血清稀释液的确定
5.2.6 最佳血清作用时间的确定
5.2.7 酶标二抗最佳工作浓度的确定
5.2.8 酶标二抗最佳作用时间的确定
5.2.9 底物最佳作用时间的确定
5.2.10 临界值的确定
5.2.11 特异性试验
5.2.12 敏感性试验
5.2.13 重复性试验
5.2.14 对比试验
5.3 结果
5.3.1 方阵滴定法确定蛋白最佳包被浓度和最佳血清稀释度
5.3.2 抗原最佳包被条件的确定
5.3.3 最佳封闭液的确定
5.3.4 封闭时间的确定
5.3.5 最佳血清稀释液的确定
5.3.6 血清最佳作用时间的确定
5.3.7 酶标二抗最佳工作浓度的确定
5.3.8 酶标二抗最佳作用时间的确定
5.3.9 底物最佳作用时间的确定
5.3.10 最终反应条件的确定
5.3.11 临界值的确定
5.3.12 特异性试验
5.3.13 敏感性试验
5.3.14 重复性试验
5.3.15 对比试验
5.4 讨论
第六章 SUMO-VP0、SUMO-VP1 及 SUMO-VP3 蛋白的豚鼠免疫试验
6.1 材料
6.1.1 主要试剂及实验动物
6.1.2 主要仪器
6.2 方法
6.2.1 抗原的制备
6.2.2 动物分组和免疫程序
6.2.3 豚鼠血清中 FMDV 抗体的检测
6.3 结果
6.3.1 豚鼠血清中 FMDV 抗体的检测
6.4 讨论
第七章 结论
参考文献
附录
致谢
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]口蹄疫诊断技术研究进展[J]. 武刚,王洪梅,刘晓,宋玲玲,陈莉莉,仲跻峰,何洪彬. 家畜生态学报. 2011(02)
[2]口蹄疫诊断技术的研究进展[J]. 刘明,徐娜,李志勇,柳纪省. 生物技术通报. 2010(05)
[3]口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法的建立[J]. 秦智锋,曾少灵,阮周曦,陈兵,曹琛福,花群义,吕建强,叶奕优,范万红,毕英佐. 中国预防兽医学报. 2008(05)
[4]基因芯片技术及口蹄疫病毒基因芯片研究进展[J]. 王建东,郭建宏,杨春生,刘在新. 动物医学进展. 2007(S1)
[5]口蹄疫病毒VP2基因的原核表达及抗原性检测[J]. 曲哲会,王君伟,郭晓秋,李刚,李洪涛. 中国预防兽医学报. 2007(02)
[6]环介导等温基因扩增技术及其应用研究进展[J]. 常小斌,刘洵,程天印,王小君,陈宇明. 畜牧兽医科技信息. 2006(12)
[7]应用寡核苷酸芯片检测猪口蹄疫病毒的初步研究[J]. 杨林,张桂红,钟植文,廖明,王升启. 中国畜牧兽医. 2006(12)
[8]口蹄疫检测能力比对试验的结果分析[J]. 周碧君,李谦,汪德生. 山地农业生物学报. 2006(02)
[9]口蹄疫诊断技术研究进展[J]. 王莉娟,徐天刚,赵云玲,陆明哲,陈义平,曹洪敬,蔡丽娟. 中国畜牧兽医. 2005(03)
[10]口蹄疫病毒P1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物活性的初步分析[J]. 余晓岚,肖少波,方六荣,胡梦雨,严琳,董晓辉,陈焕春. 生物工程学报. 2005(01)
硕士论文
[1]牛口蹄疫病毒VP2-ELISA和3B表位串联肽间接ELISA试剂盒的研制[D]. 张润祥.东北农业大学 2010
[2]口蹄疫病毒结构蛋白VP1和VP1 C末端的免疫原性研究及VP1-ELISA方法的建立[D]. 王光华.甘肃农业大学 2007
[3]口蹄疫病毒环介导等温扩增检测方法的建立与评价[D]. 孙晓智.内蒙古农业大学 2007
本文编号：3161111
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 口蹄疫
1.1.1 口蹄疫的危害及流行现状
1.1.2 口蹄疫病原特征
1.1.3 O 型口蹄疫病毒抗原位点研究进展
1.2 口蹄疫诊断技术研究进展
1.2.1 临床诊断
1.2.2 生物学诊断技术
1.2.3 血清学诊断
1.2.4 分子生物学技术
1.2.5 其他方法
1.3 本研究的目的及意义
第二章 猪 O 型口蹄疫病毒结构蛋白基因 VP0、VP1、VP3的克隆及表达载体的构建
2.1 材料
2.1.1 病毒基因、菌株与载体
2.1.2 主要试剂及酶
2.1.3 主要仪器
2.2 方法
2.2.1 病毒基因合成
2.2.2 引物的设计与合成
2.2.3 VP0、VP1、VP3 基因片段的 PCR 扩增
2.2.4 VP0、VP1、VP3 基因 PCR 产物的回收
2.2.5 VP0、VP1、VP3 基因的克隆
2.2.6 感受态细胞的制备
2.2.7 重组质粒转化 E.coli DH5
2.2.8 重组质粒的提取
2.2.9 重组质粒的 PCR 鉴定
2.2.10 重组质粒的双酶切鉴定
2.2.11 重组质粒的测序鉴定
2.2.12 原核表达质粒的构建
2.2.13 连接产物转化 E.coli DH5
2.2.14 原核表达质粒的提取
2.2.15 原核表达质粒的 PCR 鉴定
2.2.16 原核表达质粒的双酶切鉴定
2.2.17 原核表达质粒的测序鉴定
2.2.18 原核表达质粒转化 BL21（DE3）plysS
2.2.19 原核表达质粒的提取及鉴定
2.3 结果
2.3.1 VP0、VP1、VP3 基因的扩增
2.3.2 重组质粒的 PCR 鉴定
2.3.3 重组质粒的双酶切鉴定
2.3.4 重组质粒的测序鉴定
2.3.5 原核表达质粒的 PCR 鉴定
2.3.6 原核表达质粒的双酶切鉴定
2.3.7 原核表达质粒的测序鉴定
2.4 讨论
第三章 猪 O 型口蹄疫病毒结构蛋白的原核表达及可溶性表达条件的摸索
3.1 材料
3.1.1 主要试剂及酶
3.1.2 主要仪器
3.2 方法
3.2.1 原核表达质粒在大肠杆菌中的诱导表达
3.2.2 SDS-PAGE 分析
3.2.3 Western blot 分析
3.2.4 目的蛋白大量表达的预处理
3.2.5 目的蛋白可溶性表达条件的摸索
3.3 结果
3.3.1 SDS-PAGE 分析结果
3.3.2 Western blot 分析结果
3.3.3 目的蛋白大量表达的预处理结果
3.3.4 目的蛋白可溶性表达条件的摸索
3.4 讨论
第四章 SUMO-VP0、SUMO-VP1、SUMO-VP3 及 VP3 蛋白的纯化
4.1 材料
4.1.1 主要试剂及酶
4.1.2 主要仪器
4.2 方法
4.2.1 透析袋的处理及保存
4.2.2 蛋白的重折叠处理
4.2.3 通过 BCA 蛋白定量分析法测定样品中蛋白含量
4.2.4 蛋白的纯化
4.2.5 蛋白的浓缩
4.2.6 测定浓缩后蛋白样品中蛋白含量
4.3 结果
4.3.1 纯化产物的 SDS-PAGE 分析
4.3.2 VP3 蛋白的特异性分析
4.4 讨论
第五章 SUMO-VP0、SUMO-VP1、SUMO-VP3 及 VP3 蛋白间接 ELISA 方法的建立
5.1 材料
5.1.1 主要试剂及酶
5.1.2 主要仪器
5.2 方法
5.2.1 方阵滴定法确定蛋白最佳包被浓度及血清最佳稀释度
5.2.2 最佳抗原包被条件的确定
5.2.3 最佳封闭液的确定
5.2.4 最佳封闭条件的确定
5.2.5 最佳血清稀释液的确定
5.2.6 最佳血清作用时间的确定
5.2.7 酶标二抗最佳工作浓度的确定
5.2.8 酶标二抗最佳作用时间的确定
5.2.9 底物最佳作用时间的确定
5.2.10 临界值的确定
5.2.11 特异性试验
5.2.12 敏感性试验
5.2.13 重复性试验
5.2.14 对比试验
5.3 结果
5.3.1 方阵滴定法确定蛋白最佳包被浓度和最佳血清稀释度
5.3.2 抗原最佳包被条件的确定
5.3.3 最佳封闭液的确定
5.3.4 封闭时间的确定
5.3.5 最佳血清稀释液的确定
5.3.6 血清最佳作用时间的确定
5.3.7 酶标二抗最佳工作浓度的确定
5.3.8 酶标二抗最佳作用时间的确定
5.3.9 底物最佳作用时间的确定
5.3.10 最终反应条件的确定
5.3.11 临界值的确定
5.3.12 特异性试验
5.3.13 敏感性试验
5.3.14 重复性试验
5.3.15 对比试验
5.4 讨论
第六章 SUMO-VP0、SUMO-VP1 及 SUMO-VP3 蛋白的豚鼠免疫试验
6.1 材料
6.1.1 主要试剂及实验动物
6.1.2 主要仪器
6.2 方法
6.2.1 抗原的制备
6.2.2 动物分组和免疫程序
6.2.3 豚鼠血清中 FMDV 抗体的检测
6.3 结果
6.3.1 豚鼠血清中 FMDV 抗体的检测
6.4 讨论
第七章 结论
参考文献
附录
致谢
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]口蹄疫诊断技术研究进展[J]. 武刚,王洪梅,刘晓,宋玲玲,陈莉莉,仲跻峰,何洪彬. 家畜生态学报. 2011(02)
[2]口蹄疫诊断技术的研究进展[J]. 刘明,徐娜,李志勇,柳纪省. 生物技术通报. 2010(05)
[3]口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法的建立[J]. 秦智锋,曾少灵,阮周曦,陈兵,曹琛福,花群义,吕建强,叶奕优,范万红,毕英佐. 中国预防兽医学报. 2008(05)
[4]基因芯片技术及口蹄疫病毒基因芯片研究进展[J]. 王建东,郭建宏,杨春生,刘在新. 动物医学进展. 2007(S1)
[5]口蹄疫病毒VP2基因的原核表达及抗原性检测[J]. 曲哲会,王君伟,郭晓秋,李刚,李洪涛. 中国预防兽医学报. 2007(02)
[6]环介导等温基因扩增技术及其应用研究进展[J]. 常小斌,刘洵,程天印,王小君,陈宇明. 畜牧兽医科技信息. 2006(12)
[7]应用寡核苷酸芯片检测猪口蹄疫病毒的初步研究[J]. 杨林,张桂红,钟植文,廖明,王升启. 中国畜牧兽医. 2006(12)
[8]口蹄疫检测能力比对试验的结果分析[J]. 周碧君,李谦,汪德生. 山地农业生物学报. 2006(02)
[9]口蹄疫诊断技术研究进展[J]. 王莉娟,徐天刚,赵云玲,陆明哲,陈义平,曹洪敬,蔡丽娟. 中国畜牧兽医. 2005(03)
[10]口蹄疫病毒P1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物活性的初步分析[J]. 余晓岚,肖少波,方六荣,胡梦雨,严琳,董晓辉,陈焕春. 生物工程学报. 2005(01)
硕士论文
[1]牛口蹄疫病毒VP2-ELISA和3B表位串联肽间接ELISA试剂盒的研制[D]. 张润祥.东北农业大学 2010
[2]口蹄疫病毒结构蛋白VP1和VP1 C末端的免疫原性研究及VP1-ELISA方法的建立[D]. 王光华.甘肃农业大学 2007
[3]口蹄疫病毒环介导等温扩增检测方法的建立与评价[D]. 孙晓智.内蒙古农业大学 2007
本文编号：3161111
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