诺维氏梭菌的培养、鉴定方法的建立及其α毒素单克隆抗体和多克隆抗体的制备

发布时间：2021-04-26 14:17

　　诺维氏梭菌（Clostridium novyi）曾被称为水肿梭菌（Clostridium oedematiens）、水肿杆菌、第二型恶性水肿杆菌、巨大杆菌和水牛梭菌等,它是羊黑疫的致病菌。诺维氏梭菌广泛存在于自然界特别是土壤之中,饲草被芽胞体污染后,经羊采食,芽胞从胃肠壁经目前尚未阐明的途径到达肝脏引起发病。羊、牛均可感染。该菌可以使1岁以上的绵羊发病,山羊也可以患此病,牛仅偶发感染。由诺维氏梭菌引起的羊黑疫发病急,死亡快,家畜往往还没有表现出明显症状就死亡,部分病例可拖延1² d,但没有超过3 d的,给畜牧业带来了巨大损失。因此,亟需建立在羊群快速鉴定诺维氏梭菌的血清学检测技术,如ELISA诊断方法等。诺维氏梭菌属严格厌氧菌,其生长繁殖对营养要求和环境要求高,常见的培养基不能满足其需要。为了获得高密度的细菌培养物,满足实验室或疫苗生产的需要,须合成新的培养基;为了制备新的诊断试剂盒如ELISA试剂盒等,须制备天然毒素、单克隆抗体、多克隆抗体;为了获得单克隆抗体和多克隆抗体,在天然毒素获得困难的情况下,须用重组蛋白代替天然毒素。该病死亡快,为了实现现场在羊群快速诊... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
1 引言
    1.1 诺维氏梭菌介绍
    1.2 相关菌介绍
        1.2.1 腐败梭菌
        1.2.2 产气荚膜梭菌
    1.3 诺维氏梭菌培养现状
    1.4 PCR技术
    1.5 本课题的研究目的及意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 实验动物、菌株及细胞
        2.1.2 主要的试剂及溶液的配制
        2.1.3 主要试验仪器
    2.2 方法
        2.2.1 菌种复苏
        2.2.2 菌种保存
        2.2.3 诺维氏梭菌增菌培养基探索
        2.2.4 诺维梭菌、腐败梭菌、产气荚膜梭菌的PCR检测
        2.2.5 天然毒素的制备
        2.2.6 诺维氏梭菌α天然毒素蛋白鉴定的SDS-PAGE检测技术
        2.2.7 实验动物感染
        2.2.8 诺维氏梭菌重组蛋白的原核表达
        2.2.9 单克隆抗体的制备
        2.2.10 BALB/c小鼠单克隆抗体腹水的制备
        2.2.11 BALB/c小鼠单克隆抗体腹水的纯化
        2.2.12 单克隆抗体的效价检测
        2.2.13 单克隆抗体特异性的鉴定
        2.2.14 阳性杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体稳定性的测定
        2.2.15 小鼠单克隆抗体Ig亚类的鉴定
        2.2.16 多克隆抗体的制备
3 结果和分析
    3.1 菌株培养及其特性分析结果
    3.2 诺维氏梭菌增菌培养基培养效果
    3.3 诺维梭菌的PCR检测结果
        3.3.1 PCR扩增结果
        3.3.2 PCR检测的特异性、重复性试验结果
        3.3.3 PCR检测的临床应用效果
    3.4 诺维氏梭菌天然毒素的纯化结果
    3.5 诺维氏梭菌动物感染实验
    3.6 诺维氏梭菌α毒素重组蛋白的原核表达
        3.6.1 基因合成和构建结果
        3.6.2 质粒构建酶切结果
        3.6.3 诺维氏梭菌重组蛋白表达结果
        3.6.4 诺维氏梭菌重组蛋白Western Blot验证结果
    3.7 诺维氏梭菌单克隆抗体的制备结果
        3.7.1 免疫BALB/c小鼠抗体效价的检测结果
        3.7.2 阳性杂交瘤细胞株的建立结果
        3.7.3 杂交瘤细胞的生长情况
    3.8 阳性杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体稳定性测定结果
    3.9 单克隆抗体亚型鉴定结果
    3.10 腹水的纯化及浓度测定结果
    3.11 单克隆抗体的特性鉴定
        3.11.1 单克隆抗体效价的测定结果
        3.11.2 单克隆抗体特异性鉴定结果
        3.11.3 Western Blot实验结果
    3.12 诺维氏梭菌多克隆抗体的制备结果
4 讨论
    4.1 选取重组蛋白的原因
    4.2 天然α毒素的制备及纯化
    4.3 杂交瘤细胞的融合和筛选
    4.4 阳性杂交瘤细胞的扩大培养
    4.5 单克隆抗体的纯化
    4.6 单克隆抗体特异性的鉴定
    4.7 多克隆抗体的制备
    4.8 单克隆抗体和多克隆抗体制备出来的意义
5 结论
参考文献
附录
致谢
发表论文情况


【参考文献】：
期刊论文
[1]浅谈羊黑疫防治[J]. 魏丽君.  山东畜牧兽医. 2018(03)
[2]羊黑疫的诊断与防治[J]. 王菊文,韩涛,任禾,冯学俊,沈辰峰,王杰,樊华,陈世军.  现代农业科技. 2018(03)
[3]羊黑疫的流行病学、临床表现、鉴别诊断及防控措施[J]. 王杨,王军.  现代畜牧科技. 2018(02)
[4]羊黑疫的临床表现、实验室诊断及防控措施[J]. 柴晓虹.  现代畜牧科技. 2017(11)
[5]羊梭菌病的预防和治疗[J]. 张成.  中国动物保健. 2017(06)
[6]腐败梭菌引起的羊疫病防治[J]. 丁环.  山东畜牧兽医. 2017(06)
[7]羊诺维梭菌病的诊治[J]. 王仁虎.  乡村科技. 2016(33)
[8]猪恶性水肿病的流行、诊断及防治措施[J]. 朱万柏,周宏亮,周立新.  现代畜牧科技. 2016(11)
[9]山羊传染性坏死性肝炎的诊治[J]. 邓广福.  当代畜牧. 2016(29)
[10]产气荚膜梭菌α毒素免疫组化检测方法的建立[J]. 秦贵平,陈长俊,林晓佳,吴洁,杨文浩,王海荣,柴同杰.  中国预防兽医学报. 2016(10)

硕士论文
[1]产气荚膜梭菌α毒素抗体捕获ELISA检测方法的建立和初步应用[D]. 楚国茹.山东农业大学 2017
[2]不同源产气荚膜梭菌交叉感染及类毒素疫苗免疫保护效果比较[D]. 温新水.山东农业大学 2017
[3]产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体的制备及鉴定[D]. 李翠松.山东农业大学 2016
[4]C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗与抗毒素血清的制备研究[D]. 樊金.山东农业大学 2015
[5]产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体的制备及鉴定[D]. 刘萌萌.山东农业大学 2015
[6]产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用[D]. 孙佳芝.山东农业大学 2014
[7]羊源产气荚膜梭菌的分离鉴定与α毒素的原核表达和免疫原性研究[D]. 李娜.石河子大学 2013
[8]腐败梭菌α毒素基因克隆和表达的研究[D]. 张燕.河北师范大学 2006



本文编号：3161558