PRRSV感染对树突状细胞自噬及抗原提呈相关基因转录水平的影响
发布时间：2021-04-28 03:01
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）,是一种免疫抑制性RNA病毒,给全世界范围内养猪行业带来了巨大的经济损失,由于PRRSV的致病机制尚不明确,故目前未能有效根除该疾病,最近研究表明PRRSV感染机体后会诱发机体产生自噬现象,并且利用机体细胞的自噬进行病毒自身的复制,而自噬靶蛋白m TOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,是自噬信号通路中重要的靶点,可以调控下游蛋白磷酸化,从而影响下游通路的正常运行。树突状细胞是联系天然免疫和特异性的天然桥梁,在免疫应答中发挥重要作用。故本论文旨在通过研究PRRSV感染引起树突状细胞发生自噬,进而采用自噬的激活剂以及抑制剂来调节自噬的主要靶点,从而通过调节自噬水平来达到抑制PRRSV复制的目的。本实验共分为6组,分别为DC（树突状细胞）对照组,Rapa（雷帕霉素）处理组,3-MA（3-甲基腺嘌呤）处理组,PRRSV组,Rapa+PRRSV组和3-MA+PRRSV组。首先诱导培养树突状细胞以及测定PRRSV毒价,其次检测了PRRSV对树突状细胞抗原提呈功能及自噬的影响,最后分别通过自噬激活剂和抑制剂来调节自噬靶蛋m TOR,进而检测自噬靶蛋白m TOR在PRRS...
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩略表
文献综述
1.1 猪繁殖与呼吸综合征的概述
1.1.1 流行病学
1.1.2 PRRSV的病原学特征
1.1.3 PRRSV的易感细胞
1.1.4 致病机制
1.2 自噬的研究进展
1.2.1 自噬的发生以及分类
1.2.2 细胞自噬的检测方法
1.2.3 自噬与凋亡的区别
1.2.4 mTOR信号通路的生物学功能
1.2.5 PI3K和(mTOR)信号通路在(PRRSV)复制中的作用
第一章 树突状细胞的诱导培养及PRRSV毒价的测定
1.1 材料
1.1.1 试验动物及PRRSV来源
1.1.2 主要耗材
1.1.3 主要药品以及试剂
1.1.4 主要仪器设备
1.1.5 药品与试剂的制备
1.1.6 设计合成引物
1.2 试验方法
1.2.1 PRRSV的培养
1.2.2 TCID_(50)测定
1.2.3 猪外周血的采集
1.3 试验结果与分析
1.3.1 TCID_(50)测定结果
1.3.2 树突状细胞原代培养及诱导的结果
1.4 讨论
1.4.1 影响PRRSV毒价的测定的因素
1.4.2 影响树突细胞的诱导的因素
1.5 小结
第二章 PRRSV感染对树突状细胞自噬和抗原提呈功能的影响
2.1 材料与方法
2.1.1 实验对象
2.1.2 实验耗材
2.1.3 药品及试剂
2.1.4 仪器与设备
2.1.5 主要药品与试剂的配制
2.2 实验方法
2.2.1 树突状细胞接种PRRSV
2.2.2 MDC染色最佳浓度与最佳时间的确定
2.2.3 PRRSV接种树突状细胞后激光共聚焦的检测
2.2.4 PRRSV接种树突状细胞后不同时间段病毒载量的检测
2.2.5 树突状细胞接种PRRSV后自噬基因与抗原提呈基因的检测
2.2.6 树突状细胞接种PRRSV后凋亡基因的检测
2.2.7 Western blot方法检测LC 3I/II蛋白的表达量
2.3 结果与分析
2.3.1 树突状细胞的形态学变化
2.3.2 MDC最适浓度与时间的筛选结果
2.3.3 激光共聚焦检测
2.3.4 PRRSV的病毒载量检测结果
2.3.5 树突状细胞自噬和抗原提呈基因的检测结果
2.3.6 PRRSV感染后凋亡基因的变化情况
2.3.7 PRRSV感染组与正常组DCs的LC3I/II蛋白表达量变化情况
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 自噬靶蛋白MTOR在PRRSV感染中对树突状细胞抗原提呈功能调控的研究
3.1 材料
3.1.1 主要耗材
3.1.2 主要药品与试剂
3.1.3 主要仪器设备
3.1.4 主要药品与试剂的配制
3.1.5 设计合成引物
3.2 实验方法
3.2.1 自噬激活剂Rapa最适浓度和时间的筛选
3.2.2 自噬抑制剂3-MA最适浓度和时间的筛选
3.2.3 不同处理组经过MDC染色后的倒置荧光显微镜观察
3.2.4 不同处理组经过MDC染色后的激光共聚焦显微镜观察
3.2.5 Rapa与3-Ma对PRRSV的病毒载量影响的检测
3.2.6 不同处理组自噬基因与抗原提呈基因的检测
3.2.7 Rapa/3-MA预处理1h后加入PRRSV与Rapa/3-MA和PRRSV同时加入的自噬与抗原提呈基因的检测
3.2.8 Western Blot检测自噬相关蛋白的表达量
3.3 结果与分析
3.3.1 Rapa最适浓度与时间的筛选
3.3.2 3-MA最适浓度与最适时间的筛选
3.3.3 树突状细胞经不同处理后在倒置荧光显微镜下的结果
3.3.4 树突状细胞的不同处理组在激光共聚焦下的观察结果
3.3.5 PRRSV病毒载量的变化
3.3.6 Rapa、3-MA、PRRSV、PRRSV+Rapa、PRRSV+3-MA处理条件下自噬相关基因以及抗原提呈基因的转录水平
3.3.7 Rapa/3-MA预处理1h后加入PRRSV与Rapa/3-MA与PRRSV同时加入的自噬与抗原提呈基因的变化
3.3.8 Werstern Blot检测P62的表达量
3.3.9 Werstern Blot检测Rapa、3-Ma处理对PRRSV感染树突状细胞自噬水平的影响
3.4 讨论
3.5 小结
结论
参考文献
附录 致谢
攻读学位期间文章发表情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]电针、艾灸预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌自噬相关蛋白LC 3、Beclin 1表达的影响[J]. 谭成富,王超,杜琳,刘薇薇,宋瑾,冯果,严洁,阳晶晶,唐雅妮,陈美琳,李姣兰. 针刺研究. 2018(01)
[2]自噬检测方法的研究进展[J]. 杨霞,陈琦,包玉龙,王利. 畜牧与饲料科学. 2017(07)
[3]外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白激活Akt/mTOR信号通路及调控Beclin1的研究[J]. 孙晓林,刘淑英. 中国预防兽医学报. 2017(04)
[4]硫化氢后处理对2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其与自噬潮的相关性研究[J]. 赵雯洁,王琛,孙波,单海华,王安,乔世刚. 中华危重症医学杂志(电子版). 2016(02)
[5]自噬抑制剂3-MA抑制高糖条件下猴脉络膜视网膜血管内皮细胞血管形成[J]. 杜军辉,刘佳丽,马乐,李蓉,张中,李俊琪,成静. 临床眼科杂志. 2015(05)
[6]稳定表达RFP-GFP-LC3的RAW264.7细胞株的建立[J]. 王婉,张庆,赵润鹏,徐雪维,邢应如,张荣波,吴静,胡东. 细胞与分子免疫学杂志. 2015(09)
[7]双荧光mRFP-eGFP-LC3体系在细胞自噬中的作用[J]. 黄桢钧,刘彬,刘本荣,刘少军. 贵阳医学院学报. 2015(10)
[8]GFP-LC3B真核表达载体的构建及表达鉴定[J]. 朱杰,丁丽华,刘婕,禾荣华,张亚楠,陈志达,罗晓丽,叶棋浓,吕朝晖. 生物技术通讯. 2015(04)
[9]细胞自噬与肿瘤发生关系的研究进展[J]. 崔丹蕊,刘波,刘伟. 中国科学:生命科学. 2015(06)
[10]自噬抑制剂3-MA对“饥饿状态”下心肌细胞自噬和凋亡的影响[J]. 杨翼,李章华,贺磊磊,姚宇琴,柳华,王凌骁. 武汉体育学院学报. 2014(11)
博士论文
[1]去泛素化酶USP19通过对Beclin-1去泛素化调控细胞自噬和抗病毒反应[D]. 金寿恒.中山大学 2016
[2]MiR-210靶向沉默ATG7、Bcl-2对人退变髓核细胞自噬、凋亡的影响[D]. 王程.南华大学 2016
[3]mTOR靶向抑制剂雷帕霉素对慢性粒细胞白血病细胞的作用及机制[D]. 李杰.河北医科大学 2012
硕士论文
[1]自噬相关基因Beclin-1、ATG7、ATG3、LC3在脑缺血再灌注大鼠脑组织的表达[D]. 闵鹤鸣.锦州医科大学 2017
[2]自噬抑制剂3-MA增强顺铂对神经母细胞瘤化疗效果及其分子机制的研究[D]. 尚颖.河北医科大学 2017
[3]IL-13对与人乳腺癌细胞共培养的人乳腺成纤维细胞自噬基因Beclin1和LC3Ⅱ表达的影响[D]. 邱挺.南昌大学医学院 2013
[4]HMGB1在急性胰腺炎激活自噬信号LC3II中的表达及意义[D]. 余灿.中南大学 2013
本文编号：3164672
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩略表
文献综述
1.1 猪繁殖与呼吸综合征的概述
1.1.1 流行病学
1.1.2 PRRSV的病原学特征
1.1.3 PRRSV的易感细胞
1.1.4 致病机制
1.2 自噬的研究进展
1.2.1 自噬的发生以及分类
1.2.2 细胞自噬的检测方法
1.2.3 自噬与凋亡的区别
1.2.4 mTOR信号通路的生物学功能
1.2.5 PI3K和(mTOR)信号通路在(PRRSV)复制中的作用
第一章 树突状细胞的诱导培养及PRRSV毒价的测定
1.1 材料
1.1.1 试验动物及PRRSV来源
1.1.2 主要耗材
1.1.3 主要药品以及试剂
1.1.4 主要仪器设备
1.1.5 药品与试剂的制备
1.1.6 设计合成引物
1.2 试验方法
1.2.1 PRRSV的培养
1.2.2 TCID_(50)测定
1.2.3 猪外周血的采集
1.3 试验结果与分析
1.3.1 TCID_(50)测定结果
1.3.2 树突状细胞原代培养及诱导的结果
1.4 讨论
1.4.1 影响PRRSV毒价的测定的因素
1.4.2 影响树突细胞的诱导的因素
1.5 小结
第二章 PRRSV感染对树突状细胞自噬和抗原提呈功能的影响
2.1 材料与方法
2.1.1 实验对象
2.1.2 实验耗材
2.1.3 药品及试剂
2.1.4 仪器与设备
2.1.5 主要药品与试剂的配制
2.2 实验方法
2.2.1 树突状细胞接种PRRSV
2.2.2 MDC染色最佳浓度与最佳时间的确定
2.2.3 PRRSV接种树突状细胞后激光共聚焦的检测
2.2.4 PRRSV接种树突状细胞后不同时间段病毒载量的检测
2.2.5 树突状细胞接种PRRSV后自噬基因与抗原提呈基因的检测
2.2.6 树突状细胞接种PRRSV后凋亡基因的检测
2.2.7 Western blot方法检测LC 3I/II蛋白的表达量
2.3 结果与分析
2.3.1 树突状细胞的形态学变化
2.3.2 MDC最适浓度与时间的筛选结果
2.3.3 激光共聚焦检测
2.3.4 PRRSV的病毒载量检测结果
2.3.5 树突状细胞自噬和抗原提呈基因的检测结果
2.3.6 PRRSV感染后凋亡基因的变化情况
2.3.7 PRRSV感染组与正常组DCs的LC3I/II蛋白表达量变化情况
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 自噬靶蛋白MTOR在PRRSV感染中对树突状细胞抗原提呈功能调控的研究
3.1 材料
3.1.1 主要耗材
3.1.2 主要药品与试剂
3.1.3 主要仪器设备
3.1.4 主要药品与试剂的配制
3.1.5 设计合成引物
3.2 实验方法
3.2.1 自噬激活剂Rapa最适浓度和时间的筛选
3.2.2 自噬抑制剂3-MA最适浓度和时间的筛选
3.2.3 不同处理组经过MDC染色后的倒置荧光显微镜观察
3.2.4 不同处理组经过MDC染色后的激光共聚焦显微镜观察
3.2.5 Rapa与3-Ma对PRRSV的病毒载量影响的检测
3.2.6 不同处理组自噬基因与抗原提呈基因的检测
3.2.7 Rapa/3-MA预处理1h后加入PRRSV与Rapa/3-MA和PRRSV同时加入的自噬与抗原提呈基因的检测
3.2.8 Western Blot检测自噬相关蛋白的表达量
3.3 结果与分析
3.3.1 Rapa最适浓度与时间的筛选
3.3.2 3-MA最适浓度与最适时间的筛选
3.3.3 树突状细胞经不同处理后在倒置荧光显微镜下的结果
3.3.4 树突状细胞的不同处理组在激光共聚焦下的观察结果
3.3.5 PRRSV病毒载量的变化
3.3.6 Rapa、3-MA、PRRSV、PRRSV+Rapa、PRRSV+3-MA处理条件下自噬相关基因以及抗原提呈基因的转录水平
3.3.7 Rapa/3-MA预处理1h后加入PRRSV与Rapa/3-MA与PRRSV同时加入的自噬与抗原提呈基因的变化
3.3.8 Werstern Blot检测P62的表达量
3.3.9 Werstern Blot检测Rapa、3-Ma处理对PRRSV感染树突状细胞自噬水平的影响
3.4 讨论
3.5 小结
结论
参考文献
附录 致谢
攻读学位期间文章发表情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]电针、艾灸预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌自噬相关蛋白LC 3、Beclin 1表达的影响[J]. 谭成富,王超,杜琳,刘薇薇,宋瑾,冯果,严洁,阳晶晶,唐雅妮,陈美琳,李姣兰. 针刺研究. 2018(01)
[2]自噬检测方法的研究进展[J]. 杨霞,陈琦,包玉龙,王利. 畜牧与饲料科学. 2017(07)
[3]外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白激活Akt/mTOR信号通路及调控Beclin1的研究[J]. 孙晓林,刘淑英. 中国预防兽医学报. 2017(04)
[4]硫化氢后处理对2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其与自噬潮的相关性研究[J]. 赵雯洁,王琛,孙波,单海华,王安,乔世刚. 中华危重症医学杂志(电子版). 2016(02)
[5]自噬抑制剂3-MA抑制高糖条件下猴脉络膜视网膜血管内皮细胞血管形成[J]. 杜军辉,刘佳丽,马乐,李蓉,张中,李俊琪,成静. 临床眼科杂志. 2015(05)
[6]稳定表达RFP-GFP-LC3的RAW264.7细胞株的建立[J]. 王婉,张庆,赵润鹏,徐雪维,邢应如,张荣波,吴静,胡东. 细胞与分子免疫学杂志. 2015(09)
[7]双荧光mRFP-eGFP-LC3体系在细胞自噬中的作用[J]. 黄桢钧,刘彬,刘本荣,刘少军. 贵阳医学院学报. 2015(10)
[8]GFP-LC3B真核表达载体的构建及表达鉴定[J]. 朱杰,丁丽华,刘婕,禾荣华,张亚楠,陈志达,罗晓丽,叶棋浓,吕朝晖. 生物技术通讯. 2015(04)
[9]细胞自噬与肿瘤发生关系的研究进展[J]. 崔丹蕊,刘波,刘伟. 中国科学:生命科学. 2015(06)
[10]自噬抑制剂3-MA对“饥饿状态”下心肌细胞自噬和凋亡的影响[J]. 杨翼,李章华,贺磊磊,姚宇琴,柳华,王凌骁. 武汉体育学院学报. 2014(11)
博士论文
[1]去泛素化酶USP19通过对Beclin-1去泛素化调控细胞自噬和抗病毒反应[D]. 金寿恒.中山大学 2016
[2]MiR-210靶向沉默ATG7、Bcl-2对人退变髓核细胞自噬、凋亡的影响[D]. 王程.南华大学 2016
[3]mTOR靶向抑制剂雷帕霉素对慢性粒细胞白血病细胞的作用及机制[D]. 李杰.河北医科大学 2012
硕士论文
[1]自噬相关基因Beclin-1、ATG7、ATG3、LC3在脑缺血再灌注大鼠脑组织的表达[D]. 闵鹤鸣.锦州医科大学 2017
[2]自噬抑制剂3-MA增强顺铂对神经母细胞瘤化疗效果及其分子机制的研究[D]. 尚颖.河北医科大学 2017
[3]IL-13对与人乳腺癌细胞共培养的人乳腺成纤维细胞自噬基因Beclin1和LC3Ⅱ表达的影响[D]. 邱挺.南昌大学医学院 2013
[4]HMGB1在急性胰腺炎激活自噬信号LC3II中的表达及意义[D]. 余灿.中南大学 2013
本文编号：3164672
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