减毒猪霍乱沙门菌递呈猪链球菌蛋白抗原的构建和评估

发布时间：2021-04-28 11:31

　　猪霍乱沙门菌（Salmonella enterica serovar Choleraesuis,S.Choleraesuis）是一种非伤寒沙门菌,是诱发仔猪副伤寒的主要病原体,给中国的养猪业造成了巨大的经济损失。中国预防S.Choleraesuis最有效的疫苗是C500,C500是通过化学诱变获得的一株遗传稳定、免疫性较好的弱毒株。虽然C500弱毒活疫苗使用以来,我国的仔猪副伤寒得到有效控制,但是该弱毒株仍有较高的残余毒力,且遗传背景不清楚,因此需要对C500进行优化,以获得更安全的减毒活疫苗。通过对C500株测序发现,C500有多个基因缺失或失活,包括asr、ydgF、ydgD、ydgE、rpoS和ptsG;对这些基因进行分析及动物实验发现,rpoS基因的失活是C500主要的减毒方式,这为开发更加安全的猪霍乱疫苗提供了研究基础。本文以C500疫苗株为背景菌株,回复其rpoS基因的活性,使其具备像野生株侵袭细胞的能力;然后再以回复了rpoS基因活性的减毒株为背景株,分别缺失crp、fur、phop、aroA等基因,再从这四株重组减毒株中筛选一株免疫原性较好,副作用小的疫苗株。将该疫苗株... 

【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1 猪链球菌的研究概况
        1.1 病原学和流行病学
        1.2 临床症状和病理变化
        1.3 诊断和防治
    2 猪霍乱沙门菌C500作为载体的研究概况
        2.1 荷载异源抗原的减毒沙门菌诱发免疫的机制
        2.2 C500载体系统的研究概况
        2.3 C500载体系统存在的优势与局限
第二章 引言
第三章 猪霍乱沙门菌重组减毒株的构建
    1 材料
        1.1 菌株和质粒
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器设备
        1.4 相关主要培养基、试剂的配制
    2 试验方法
        2.1 构建猪霍乱沙门菌重组减毒株的策略
        2.2 引物设计
        2.3 自杀质粒的构建
        2.4 回复rpoS基因同源重组供体菌的制备
        2.5 同源重组
        2.6 rpoS基因的回复的验证
        2.7 C5001、C5002、C5003、C5004突变株的构建
    3 结果与分析
        3.1 自杀质粒的构建
        3.2 突变株的鉴定
        3.3 rpoS基因回复的验证
        3.4 C5001、C5002、C5003、C5004减毒株的构建
    4 讨论
第四章 重组减毒株的生物学特性研究
    1 试验材料
        1.1 菌株、动物
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器设备
        1.4 相关主要培养基、试剂的配制
    2 试验方法
        2.1 各菌株生长曲线的测定
        2.2 运行性检测
        2.3 菌株的定植实验
        2.4 攻毒保护实验
        2.5 抗体水平的检测
    3 结果
        3.0 各减毒株生长曲线的测定
        3.1 运动型检测
        3.2 定植
        3.3 LPS和外膜蛋白提取检测
        3.4 抗体水平检测
        3.5 免疫保护
    4 讨论
第五章 减毒猪霍乱沙门菌递呈猪链球菌STK、GDH、ccp A蛋白的构建及其免疫原性初探
    1 材料
        1.1 菌株、质粒和动物
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器设备
        1.4 相关主要溶液的配制
    2 试验方法
        2.1 试验引物
        2.2 猪链球菌2型stk、gdh、ccp A基因的克隆
        2.3 相关蛋白在BL21中的表达及可溶性蛋白的纯化
        2.4 针对相关蛋白的兔抗血清的制备,纯化及其效价的测定
        2.5 猪链球菌SC19菌株LD50的测定
        2.6 C5001(stk、gdh、ccp A)菌株的构建及其表达
        2.7 C5001(p YA3494-stk)、C5001(p YA3494-gdh)、C5001(p YA3494-ccp A)菌株的生物学特性
    3 结果
        3.0 猪链球菌2型stk、gdh、ccp A基因的克隆
        3.1 p ET28a-stk、p ET30a-gdh、p ET28a-ccp A质粒的构建
        3.2 相关蛋白在BL21中的表达及可溶性蛋白的纯化
        3.3 针对相关蛋白的兔抗血清的制备及其效价的测定
        3.4 猪链球菌SC19菌株LD50的测定
        3.5 重组沙门菌C5001载体的构建及基因的克隆
        3.6 stk,gdh,ccp A蛋白在C5001 中的表达
        3.7 抗体水平检测结果
        3.8 动物保护性试验
    4.讨论
结论
参考文献
致谢
发表论文和申请专利


【参考文献】：
期刊论文
[1]应用减毒沙门菌载体递呈多糖抗原的研究进展[J]. 卞晓萍,刘青,孔庆科.  中国预防兽医学报. 2019(09)
[2]猪链球菌病的病因及防控措施[J]. 魏恒.  陕西农业科学. 2019(06)
[3]一例仔猪副伤寒病的诊疗报告[J]. 蒋冬福,秦毅斌,周英宁,何颖,李斌,梁家幸,卢敬专,段群棚,赵武.  养猪. 2019(03)
[4]猪链球菌病的防治[J]. 王晓华.  中国畜禽种业. 2019(02)
[5]鼠伤寒沙门菌rpoS基因缺失菌株的构建及RpoS因子在环境胁迫下的作用[J]. 梁运改,桂萌,王顺,刘密,张清,周康.  食品科学. 2018(06)
[6]减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗的研究进展[J]. 张雪彬,丁军涛.  新疆畜牧业. 2016(08)
[7]仔猪沙门氏菌病的诊断与治疗[J]. 曲晶.  现代畜牧科技. 2016(03)
[8]减毒沙门氏菌作为口服活疫苗载体的研究进展[J]. 马全英,安芳兰,刘萍,祝秀梅,吕志慧,王凡,刘学荣,黄银君,牟克斌.  贵州畜牧兽医. 2012(05)
[9]广西首例人感染猪霍乱沙门氏菌败血症报告[J]. 周正银,谢明映.  广西医科大学学报. 2011(01)
[10]猪霍乱沙门氏菌C78-1株Δcrp缺失株的构建及其生物学特性初步研究[J]. 郁川,程相朝,赵战勤,张春杰,李银聚,吴庭才.  畜牧兽医学报. 2010(05)

博士论文
[1]猪霍乱沙门氏菌C500株crpˉ、asdˉ缺失株平衡致死系统的构建及应用[D]. 徐引弟.华中农业大学 2006

硕士论文
[1]猪链球菌真核样丝氨酸/苏氨酸激酶stk基因功能的实验研究[D]. 杜骁杰.南京师范大学 2014
[2]猪链球菌噬菌体SMP的抑菌作用及其增殖动力学研究[D]. 庞亮亮.上海交通大学 2010



本文编号：3165403