猪骨骼肌MyHC-Ⅱb基因上调表达的分子机制研究

发布时间：2021-04-28 18:20

　　哺乳动物骨骼肌是由各种不同类型的肌纤维镶嵌而成的，而不同类型肌球蛋白重链（Myosin heavy chain，MyHC）的表达情况是造成不同类型肌纤维的主要原因。目前已知的肌球蛋白重链家族包含8种亚型，其中MyHC-IIb在商品猪中的表达量要显著高于其在中国地方猪种中的表达量，然而造成这种差异表达的内在机制尚且无人研究。本研究使用qRT-PCR、C2C12细胞转染、荧光素酶检测以及Western Blot等方法，对商品猪中MyHC-IIb基因表达上调的因素进行了初步的分析。结果如下：1使用荧光定量PCR的方法比较了莱芜猪（n=5）和大长杂交猪（n=4）背最长肌中MyHC-IIb mRNA的表达情况，发现MyHC-IIb mRNA在大长杂交猪中的表达量显著高于其在莱芜猪中的表达量（P=0.013<0.05）。2删除实验结果表明从转录起始位点上游-1024bp删除到-187bp之后，MyHC-IIb表达量显著下降，分析发现在这段启动子区域内存在三个E-box序列，分别突变这3个E-box序列，结果使得MyHC-IIb表达量都显著下降（P=0.036<0.05）。3另外，在My... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 猪肌肉组织
    1.2 猪骨骼肌组织
        1.2.1 猪骨骼肌结构
        1.2.2 猪骨骼肌纤维分类
        1.2.3 肌纤维类型与肉品质的关系
    1.3 肌球蛋白与肌球蛋白重链
        1.3.1 肌球蛋白
        1.3.2 肌球蛋白重链
    1.4 肌生成的分子调控机制
        1.4.1 形态发育和肌肉发育
        1.4.2 基因网络调控肌生成
    1.5 本研究的目的和意义
2 实验材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物及其处理
        2.1.2 主要实验仪器
        2.1.3 主要试剂及来源
        2.1.4 主要数据库及生物软件
        2.1.5 常用试剂的配制
    2.2 试验方法
        2.2.1 试验中用到的引物序列
        2.2.2 总 RNA 的提取和反转录
            2.2.2.1 前处理
            2.2.2.2 组织总 RNA 提取与纯化（Trizol 法）
            2.2.2.3 RNA 品质和质量检测
            2.2.2.4 Dnase I 处理
            2.2.2.5 RNA 的反转录以得到 cDNA
        2.2.3 实时荧光定量 PCR
        2.2.4 MyHC-IIb 启动子区的克隆及多态性分析
            2.2.4.1 MyHC-IIb 启动子区的克隆
            2.2.4.2 MyHC-IIb 启动子区的多态性分析
        2.2.5 表达载体构建及质粒的去内毒素处理
            2.2.5.1 表达载体构建
            2.2.5.2 质粒的去内毒素处理
        2.2.6 C2C12 细胞培养
            2.2.6.1 C2C12 细胞的复苏
            2.2.6.2 C2C12 细胞的消化传代
            2.2.6.3 C2C12 细胞的冻存
        2.2.7 转染及 Dual-Luciferase 报告基因检测
            2.2.7.1 细胞转染
            2.2.7.2 Dual-Luciferase 报告基因检测
        2.2.8 总蛋白的提取和蛋白浓度检测
            2.2.8.1 总蛋白的提取
            2.2.8.2 蛋白浓度检测
        2.2.9 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析(Western blot)
            2.2.9.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
            2.2.9.2 蛋白质印迹(Westernblot)分析
        2.2.10 统计分析
3 结果与分析
    3.1 总 RNA 提取
    3.2 莱芜猪和长白猪背最长肌中 MyHC-IIb mRNA 表达水平对比
    3.3 MyHC-IIb 启动子区的克隆及区多态性分析
        3.3.1 MyHC-IIb 启动子区的克隆
        3.3.2 MyHC-IIb 启动子区多态性分析
    3.4 C2C12 细胞的培养
    3.5 SNP 位点突变载体荧光素酶报告基因检测结果
    3.6 MyHC-IIb 启动子不同长度片段载体的构建及细胞转染结果
        3.6.1 MyHC-IIb 启动子不同长度片段载体的构建
        3.6.2 MyHC-IIb 启动子区删除实验结果
    3.7 E-box 突变载体荧光素酶报告基因检测结果
    3.8 总蛋白的提取和蛋白浓度检测
    3.9 蛋白质印迹分析(Westernblot)
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]长白猪主要性能测定及遗传参数估计研究[J]. 周立平.  湖南农业科学. 2011(07)
[2]肌纤维类型及其对猪肉品质影响的研究进展[J]. 任列娇,赵素梅,胡洪,郭雷,高士争.  云南农业大学学报. 2010(01)
[3]运动与肌球蛋白重链研究综述[J]. 苏艳红,周越,王瑞元.  天津体育学院学报. 2008(04)
[4]胚胎发育中骨骼肌组织的形成及调控[J]. 张江丽.  安徽农业科学. 2007(21)
[5]禽肉组织学性状及其与肉质的关系[J]. 潘迎丽,刘胜军,耿忠诚,贾志远.  家畜生态学报. 2006(06)
[6]猪背最长肌肌纤维类型的发育性变化及其品种和性别特点[J]. 杨晓静,赵茹茜,陈杰,胥清富,韦习会,陈杰.  中国兽医学报. 2005(01)
[7]山东地方猪种资源的现状和养猪业的发展[J]. 曾勇庆.  中国畜牧杂志. 2004(02)
[8]江西玉山猪肌肉组织学特征与肉质的关系[J]. 王亚鸣,刘龙芳.  江西农业大学学报. 1994(03)
[9]金华猪及其杂种肌肉组织学特性与肉质的关系[J]. 沈元新,徐继初.  浙江农业大学学报. 1984(03)
[10]猪肉肌纤维粗细与肉质的关系[J]. 川井田博,郁明发.  国外畜牧学(猪与禽). 1983(03)



本文编号：3165947