猪源粪肠球菌Esp的原核表达及部分LPXTG基序样物质对生物被膜形成的影响

发布时间：2021-04-29 02:50

　　肠球菌是一类广泛分布于人和温血动物肠道的革兰氏阳性球菌,且存在各种环境介质中,其中粪肠球菌和屎肠球菌是优势菌种。20世纪70年代,医院内肠球菌感染的增多,以及抗生素的滥用,出现了肠球菌耐药菌株,其对人和动物的致病性也受到了人们的重视,但兽医临床上对肠球菌的研究相对较少。肠球菌是一种重要的机会致病菌,当机体抵抗力低下时,会引起发病,肠球菌在院内主要引起心内膜炎和菌血症,还可引起多种感染。肠球菌具有形成生物被膜（Bacterial biofilm, BF）的能力,促使肠球菌感染增多且更难以治疗。BF不仅为细菌提供良好的避护所,而且机体防御系统及抗菌药物难以将其清除。对粪肠球菌BF及其机理进行深入研究,在感染的防治中有重要意义。而肠球菌儿种含有LPXTG基序样蛋白,如表面蛋白（Esp）,胶原蛋白黏附素（Ace）,聚类物质（As）,在肠球菌生物被膜的形成过程中可能起到重要作用,因此本试验通过对Esp和Ace的研究,以及相关毒力因子esp、as、 ace、gelE的表达情况与生物被膜形成的关系。以期为为制备单抗、开发疫苗及其致病机制研究奠定了基础。根据GenBank公布的肠球菌esp基因序列片段... 

【文章来源】：河南农业大学河南省

【文章页数】：60 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
摘要
文献综述
    1 肠球菌概述
        1.1 肠球菌的分类和生物学特性
        1.2 肠球菌的流行性
        1.3 肠球菌的应用
        1.4 肠球菌主要毒力因子及其致病性
    2 肠球菌的生物被膜
        2.1 生物被膜的定义
        2.2 生物被膜的形成
        2.3 生物被膜形成相关因子
            2.3.1 肠球菌表面蛋白(Enterococcal Surface Protein)
            2.3.2 菌毛(Pill)
            2.3.3 自溶素(autolysin)
            2.3.4 明胶酶(Gelatinase,GelE)
            2.3.5 粪肠球菌心内膜炎抗原(Enterococcus faecalis endocarditis antigen,EfaA)11
            2.3.6 聚集物质(AS)
            2.3.7 胶原蛋白黏附素(Ace)
            2.3.7 胞外DNA(extracellular DNA,eDNA)
            2.3.8 葡萄糖(glucose)
引言
试验一 猪源粪肠球菌表面蛋白(Esp)的基因克隆及原核表达及纯化
    1 材料
        1.1 菌株与载体
        1.2 主要仪器
        1.3 主要试剂
        1.4 主要溶液和培养基的配制
    2 方法
        2.1 DNA模板的制备
        2.2 引物选择与合成
        2.3 Esp基因的扩增
            2.3.1 PCR的反应体系
            2.3.2 PCR反应程序Esp的扩增在PCR仪上进行,反应程序如下
            2.3.3 PCR产物的回收与纯化
        2.4 重组质粒构建与鉴定
            2.4.1 PCR产物与T载体的连接
            2.4.2 感受态细胞制备
            2.4.3 重组质粒的转化
            2.4.4 小量重组质粒的筛选和提取
            2.4.5 重组质粒的鉴定
        2.5 检测肠球菌esp基因携带率
        2.6 粪肠球菌表面蛋白Esp的原核表达
            2.6.1 引物选择与合成
            2.6.2 Esp的扩增
                2.6.2.1 PCR反应体系
                2.6.2.2 PCR反应程序
                2.6.2.3 PCR产物的回收与纯化
                2.6.2.4 Esp双酶切
            2.6.3 空载体的制备
                2.6.3.1 空载体菌的纯化和扩增
                2.6.3.2 空载体的小量提取
                2.6.3.3 原核表达质粒(空载体)的双酶切
            2.6.4 重组载体的构建与鉴定
                2.6.4.1 连接反应
                2.6.4.2 表达菌BL_(21)(DE_3)感受态细胞制备
                2.6.4.3 重组质粒的转化
                2.6.4.4 重组质粒的筛选和提取
                2.6.4.5 重组质粒的鉴定
            2.6.5 重组质粒的诱导表达及纯化
                2.6.5.1 IPTG最佳诱导浓度的确定
                2.6.5.2 IPTG最佳诱导时间的确定
                2.6.5.3 大量诱导表达
                2.6.5.4 融合表达产物的可溶性鉴定
                2.6.5.5 镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化
        2.7 Western blot
    3 结果与分析
        3.1 目的基因的扩增
        3.2 扩增目的基因的序列测序
        3.3 肠球菌Esp基因的携带率
        3.4 肠球菌表面蛋白Esp原核表达结果
            3.4.1 目的基因的扩增
            3.4.2 重组质粒诱导表达条件的优化
            3.4.3 重组蛋白的纯化
            3.4.4 Western blot
    4 讨论
试验二 编码esp等LPTXG基序样物质的基因对生物被膜形成的影响
    1 材料与方法
        1.1 试验菌株
        1.2 主要试剂和仪器
        1.3 主要溶液和培养基的配制
        1.4 引物
        1.5 方法
            1.5.1 刚果红培养基筛选生物被膜菌
            1.5.2 粪肠球菌总RNA的提取
            1.5.3 反转录合成cDNA
            1.5.4 实时荧光定量PCR检测生物被膜阳性菌与生物被膜阴性菌中各基因的表达情况
            1.5.5 数据分析
    2 结果
        2.1 刚果红培养基鉴定结果
        2.2 粪肠球菌总RNA的提取结果
        2.3 基因熔解曲线
        2.4 实时荧光定量PCR检测生物被膜阳性菌与生物被膜阴性菌中各基因的表达情况
    3 讨论
试验三 猪源粪肠球菌Ace的黏附阻断及其对生物被膜形成的影响
    1 材料
        1.1 菌株、细胞与载体
        1.2 主要仪器
        1.3 主要溶液及培养基的配制
    2 方法
        2.1 IPEC-J2细胞的培养
        2.2 肠球菌的细胞黏附
        2.3 Ace对粪肠球菌生物被膜形成能力影响
        2.4 数据分析
    3 结果与分析
        3.1 黏附与抑制结果
        3.2 Ace对粪肠球菌生物被膜形成能力影响结果
    4 讨论
全文总结
参考文献
Abstract
发表论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]粪肠球菌生物被膜相关因子的研究进展[J]. 卜倩倩,伍勇.  国际检验医学杂志. 2012(08)
[2]肠球菌毒力因子的研究进展[J]. 周霞,王东,王晓兰,刘雪梅.  中国兽医学报. 2011(08)
[3]仔猪关节炎粪肠球菌生物学特性研究[J]. 王亚宾,张祥,胡清林,孟振北,陈丽颖,陈小丽,崔保安.  河南农业大学学报. 2011(02)
[4]正常人肠道肠球菌esp基因与生物膜形成关系的初探[J]. 戴锐睿,杨洋,熊鹿言,李晶洁,权泰鹏,余倩.  四川大学学报(医学版). 2010(05)
[5]粪肠球菌总RNA提取方法的比较研究[J]. 邹彬彬,漆涌,伍勇.  湖南师范大学学报(医学版). 2009(02)
[6]21例铅黄肠球菌感染的临床特征分析[J]. 谢琴秀,熊自忠.  安徽医药. 2008(10)
[7]鹑鸡肠球菌致亚急性感染性心内膜炎1例[J]. 王东文,张永,肖志斌.  实用医学杂志. 2008(16)
[8]嗜酸乳杆菌和两歧双歧杆菌体外粘附Caco-2细胞及其对病原菌粘附性能的影响[J]. 郭彤,胥保华,马玉龙,魏华.  中国兽医学报. 2008(05)
[9]4株鸭源肠球菌的鉴定和致病性[J]. 韩梅红,谷长勤,胡薛英,周诗其,杨峻,邵华斌,程国富.  中国兽医学报. 2007(06)
[10]肠球菌部分致病基因和表型的检测[J]. 马立艳,许淑珍,马纪平.  中华检验医学杂志. 2005(05)



本文编号：3166688