产气荚膜梭菌流行特点及其噬菌体遗传背景分析

发布时间：2021-05-05 16:33

　　产气荚膜梭菌是畜禽和人类肠道的常在菌,其大量繁殖时产生多种致病毒素可以导致畜禽的感染严重危害畜牧业的发展。目前,通常采用饲料中添加抗生素的方法预防畜禽的产气荚膜梭菌病,但这种方式无疑会导致耐药菌株的形成以及肠道菌群紊乱,因此亟待寻找一种有效可靠的抗生素替代品。噬菌体能特异性感染和裂解产气荚膜梭菌而又不影响目标细菌之外的微生物,使天然微生物群落不受干扰,可以作为防控产气荚膜梭菌的抗生素替代品,但产气荚膜梭菌为厌氧菌,存在噬菌体分离相对困难、噬菌谱窄、抗性发展快和溶原化的问题,因此本研究根据产气荚膜梭菌流行特点,从环境中针对性地筛选特异性噬菌体,并对产气荚膜梭菌基因组中原噬菌体进行分析,为研发防控产气荚膜梭菌的噬菌体产品提供理论依据和新的研究思路。本研究以山东省兽医抗药性监测网（Varms）为依托,通过细菌分离培养、α毒素基因的检测和质谱分析等多种鉴定方法,从临床分离不同动物源的产气荚膜梭菌流行菌株,采用（α、β、ε、ι）毒素基因PCR鉴定毒素基因型,掌握目前产气荚膜梭菌流行特点。利用PHASTER网站注释细菌基因组原噬菌体序列和噬菌体特征,通过在线网站VFDB和CARD排查完整原噬菌体区... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 产气荚膜梭菌的研究现状
        1.1.1 产气荚膜梭菌的生物学特性
        1.1.2 临床常见的产气荚膜梭菌的感染
        1.1.3 产气荚膜梭菌的抗药性
        1.1.4 产气荚膜梭菌的防控现状
    1.2 噬菌体与噬菌体治疗
        1.2.1 噬菌体概述
        1.2.2 噬菌体作用机制
        1.2.3 噬菌体治疗
            1.2.3.1 高精度噬菌体疗法
            1.2.3.2 噬菌体鸡尾酒疗法
            1.2.3.3 噬菌体与抗生素联合治疗
            1.2.3.4 原噬菌体的开发
    1.3 产气荚膜梭菌噬菌体研究进展
    1.4 研究目的与意义
2 材料和方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 样品采集
        2.1.2 主要试验材料
        2.1.3 主要试验试剂与配制方法
        2.1.4 引物合成
        2.1.5 主要仪器
        2.1.6 主要数据分析软件和网站
    2.2 方法
        2.2.1 产气荚膜梭菌的分离鉴定
            2.2.1.1 产气荚膜梭菌的样品采集和培养方法
            2.2.1.2 疑似产气荚膜梭菌生化鉴定
            2.2.1.3 分离株的PCR鉴定
            2.2.1.4 质谱分析
            2.2.1.5 产气荚膜梭菌分离菌株的保存
        2.2.2 产气荚膜梭菌的毒素基因型鉴定
            2.2.2.1 β 、ε 、ι毒素基因的PCR检测
            2.2.2.2 β2、NetB、cpe毒素基因的PCR检测
        2.2.3 原噬菌体预测
        2.2.4 噬菌体的分离
            2.2.4.1 样品处理
            2.2.4.2 产气荚膜梭菌的复苏
            2.2.4.3 共培养法分离噬菌体
            2.2.4.4 噬菌体纯化
            2.2.4.5 噬菌体的扩增
            2.2.4.6 噬菌体的冻存
        2.2.5 产气荚膜梭菌噬菌体基本生物学特性分析
            2.5.5.1 效价测定
            2.5.5.2 产气荚膜梭菌噬菌体的裂解谱测定
            2.5.5.3 产气荚膜梭噬菌体最佳感染复数测定
            2.5.5.4 产气荚膜梭噬菌体最适生长温度测定
            2.5.5.5 产气荚膜梭噬菌体pH值稳定性测定
            2.5.5.6 产气荚膜梭噬菌体一步生长曲线测定
        2.2.6 噬菌体全基因组分析
            2.2.6.1 噬菌体的浓缩提取和纯化
            2.2.6.2 噬菌体全基因组测序
            2.2.6.3 基因组的ORF预测及功能注释
            2.2.6.4 系统发育关系分析和基因组同源性分析
        2.2.7 统计学分析
3 结果与分析
    3.1 产气荚膜梭菌分离鉴定与遗传生化分析
        3.1.1 产气荚膜梭菌的分离
        3.1.2 疑似产气荚膜梭菌的形态学鉴定
        3.1.3 疑似产气荚膜梭菌的主要生化鉴定
        3.1.4 疑似产气荚膜梭菌的PCR鉴定结果
        3.1.5 疑似产气荚膜梭菌的质谱鉴定结果
        3.1.6 产气荚膜梭菌毒素基因型鉴定
        3.1.7 cpe毒素检测
        3.1.8 β2 毒素检测
        3.1.9 NetB毒素检测
        3.1.10 产气荚膜梭菌的分离情况和毒素类型分布
        3.1.11 原噬菌体分析
    3.2 噬菌体的生物学和基因组分析
        3.2.1 噬菌体分离结果
        3.2.2 噬菌体效价
        3.2.3 噬菌体裂解谱
        3.2.4 噬菌体最佳感染复数
        3.2.5 产气荚膜梭菌噬菌体的pH稳定性
        3.2.6 产气荚膜梭菌噬菌体的最适生长温度
        3.2.7 产气荚膜梭菌噬菌体的一步生长曲线
    3.3 产气荚膜梭菌噬菌体全基因组分析
        3.3.1 基因组组装结果
        3.3.2 噬菌体基因组ORF分析及功能注释结果
        3.3.3 噬菌体系统发育关系分析
        3.3.4 噬菌体基因组同源性分析
4 讨论
    4.1 产气荚膜梭菌的分布
    4.2 不同动物源产气荚膜梭菌毒素基因型分布情况
    4.3 原噬菌体分析
    4.4 噬菌体的分离方法
    4.5 噬菌体的生物学特性分析
    4.6 噬菌体基因组学分析
5 结论
6 参考文献
7 附录
8 致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪链球菌的烈性噬菌体和前噬菌体[J]. 汤芳,陆承平.  微生物学报. 2015(04)
[2]鸡产气荚膜梭菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 艾地云,邵华斌,张腾飞,詹丽超,罗玲,张蓉蓉,汪宏才,王红琳,罗青平,温国元.  动物医学进展. 2014(06)
[3]四川地区鸡源产气荚膜梭菌的分离鉴定与基因分型[J]. 倪学勤,宋振银,曾东,郑晓丽,Joshua Gong.  中国人兽共患病学报. 2009(08)
[4]多重PCR检测圈养牛、猪和羊源魏氏梭菌[J]. 王磊,裴兰英,万雪,马保臣,段会勇,柴同杰.  中国预防兽医学报. 2006(01)

博士论文
[1]山东省四大湖（库）淡水鱼产气荚膜梭菌毒素型调查及致病机理研究[D]. 蔡玉梅.山东农业大学 2008



本文编号：3170218