IL-1β和IL-1Ra双荧光ELISA检测方法的建立及其初步应用

发布时间：2021-05-06 14:57

　　白细胞介素1（Interleukin 1,IL-1）是参与炎症和免疫反应的内源性细胞因子家族之一,在宿主对抗胞内微生物（如李斯特菌或布鲁氏杆菌）中起着重要作用。其中,白介素1α（IL-1α）、白介素1β（IL-1β）和由IL-1RN编码的白介素1受体拮抗因子（IL-1Ra）是IL-1家族的重要成员。因此,研究IL-1β与IL-1Ra之间的平衡关系对维持机体的稳态以及控制相关疾病发生发展提供了一个新的思路。布鲁氏菌病（简称“布病”）是由布鲁氏菌引起的人兽共患病,严重危害人与动物的健康。动物布病疫苗的使用有助于布病预防。但使用疫苗后,现有的免疫学检测方法无法区分布病自然感染动物和疫苗免疫动物,导致无法有效扑杀布病患病动物,严重阻碍了布病的净化与防控。本课题组前期工作通过构建布鲁氏菌强毒、弱毒株感染绵羊白细胞层抑制性消减杂交（SSH）cDNA文库,筛选到差异表达基因白介素1β（IL-1β）和白介素1受体拮抗因子（IL-1Ra）,并证明布鲁氏菌疫苗株与野毒株感染可引起这两个基因存在明显的差异表达现象。因此,本研究建立了IL-1β及其拮抗因子的双荧光ELISA检测方法,并初步探讨其区分布病自然感... 

【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：99 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
abstract
前言
第一篇 文献综述
    1 布鲁氏菌病
    2 IL-1家族简介
    3 IL-1和IL-1Ra在正常机体中的生理平衡
    4 IL-1β和IL-1Ra在布鲁氏菌病诊断的应用
    5 IL-1β和IL-1Ra与其它疾病的关系
        5.1 IL-1β和IL-1Ra与关节炎的关系
        5.2 IL-1β和IL-1Ra与炎症性肠病关系
        5.3 IL-1β和IL-1Ra与肺病的关系
        5.4 IL-1β和IL-1Ra与肾病的关系
        5.5 IL-1β和IL-1Ra与肝脏和胰腺疾病的关系
        5.6 IL-1β和IL-1Ra与癌症的关系
        5.7 IL-1β和IL-1Ra与其它疾病的关系
    6 IL-1β和IL-1Ra的相关检测方法
第二篇 研究内容
    第1章 IL-1β和IL-1Ra同源保守序列分析与表达
        1.1 材料
            1.1.1 引物
            1.1.2 主要试剂
            1.1.3 主要仪器设备
            1.1.4 主要材料制备
        1.2 方法
            1.2.1 IL-1β和IL-1Ra保守区序列的选择及引物设计
            1.2.2 IL-1β和IL-1Ra目标片段的克隆
            1.2.3 PCR产物纯化和IL-1β-2与IL-1Ra-2基因串联
            1.2.4 pMCSG9载体质粒提取
            1.2.5 pMCSG9-IL-1β-1和pMCSG9-IL-1Ra-1表达菌的构建
            1.2.6 pMCSG9-IL-1β-1Ra-2表达菌的构建
            1.2.7 重组蛋白表达与纯化
        1.3 结果
            1.3.1 IL-1β和IL-1Ra保守序列的选择
            1.3.2 IL-1β和IL-1Ra保守区片段的克隆
            1.3.3 IL-1β与IL-1Ra的基因串联
            1.3.4 pMCSG9-IL-1β-1和pMCSG9-IL-1Ra-1转化入DH5α菌液鉴定
            1.3.5 pMCSG9-IL-1β-1Ra-2表达载体的构建
            1.3.6 IL-1β-1、IL-1Ra-1和IL-1β-1Ra-2蛋白的表达和纯化
        1.4 讨论
        1.5 小结
    第2章 IL-1β和IL-1Ra多克隆抗体的制备与特性分析
        2.1 材料
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 主要仪器
            2.1.3 主要材料
        2.2 方法
            2.2.1 动物免疫
            2.2.2 抗体效价检测
            2.2.3 多克隆抗体的纯化
            2.2.4 抗体鉴定与分析
        2.3 结果
            2.3.1 多克隆抗体的纯化
            2.3.2 多克隆抗体的特异性分析
            2.3.3 多克隆抗体与天然IL-1β和IL-1Ra蛋白结合
        2.4 讨论
        2.5 小结
    第3章 IL-1β和IL-1Ra双荧光ELISA检测方法的建立
        3.1 材料
            3.1.1 主要试剂
            3.1.2 主要仪器
            3.1.3 主要材料
        3.2 方法
            3.2.1 检测抗体偶联荧光微球
            3.2.2 ELISA条件的优化
            3.2.3 ELISA标准曲线的建立及回收率分析
            3.2.4 ELISA最低检测限的确定
            3.2.5 IL-1β和IL-1Ra双抗体夹心荧光ELISA方法的评价
        3.3 结果
            3.3.1 检测多抗偶联荧光微球
            3.3.2 捕获抗体与检测抗体的最佳工作浓度的确定
            3.3.3 抗原作用时间与检测抗体作用时间的确定
            3.3.4 最佳封闭时间的确定
            3.3.5 标准曲线及回收率
            3.3.6 最低检测限的确定
            3.3.7 双抗体夹心双荧光ELISA方法的性能评价
        3.4 讨论
        3.5 小结
    第4章 IL-1β和IL-1Ra双荧光ELISA检测方法临床实际样品检测应用分析
        4.1 材料
            4.1.1 样品采集
            4.1.2 主要试剂
            4.1.3 主要仪器
            4.1.4 主要材料
        4.2 方法
            4.2.1 布鲁氏菌病相关羊血样中IL-1β和IL-1Ra含量分析
            4.2.2 IBD模型小鼠血清样品中IL-1β和IL-1Ra含量分析
            4.2.3 健康人血清样中IL-1β和IL-1Ra含量分析
        4.3 结果
            4.3.1 羊IL-1β和IL-1Ra检测分析
            4.3.2 IBD模型小鼠IL-1β和IL-1Ra检测分析
            4.3.3 人血清样品IL-1β和IL-1Ra检测
        4.4 讨论
        4.5 小结
结论
参考文献
导师简介
作者简介及在学期间所取得的科研成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]Brucellosis: a lymphoma-like presentation[J]. Marcel Massoud,Fouad Kerbage,Leony Antoun,Ribal Merhi,Souheil Hallit,Rabih Hallit.  Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 2017(08)
[2]火针对类风湿性关节炎大鼠血清白介素-1和肿瘤坏死因子-α的影响[J]. 韩润霞,杨晶,张天生,张卫东.  针刺研究. 2012(02)
[3]布鲁氏菌病的研究与防控进展[J]. 任洪林,卢士英,周玉,李兆辉,柳增善.  中国畜牧兽医. 2009(09)
[4]细胞因子检测方法进展[J]. 姜威,袁颖,袁晓燕.  医学检验与临床. 2007(04)
[5]肿瘤坏死因子α和白细胞介素-1 β mRNA在大鼠肝缺血再灌注损伤时肺组织中的表达及意义[J]. 王红梅,唐菲,张建龙,卞文安.  中华肝脏病杂志. 2005(05)
[6]IgA肾病和紫癜性肾炎患者单核细胞白细胞介素-1受体拮抗剂的产生能力受其基因多态性的影响（英文）[J]. 刘志红,杨俊伟,陈朝红,龚如军,黎磊石.  Chinese Medical Journal. 2001(12)

硕士论文
[1]绵羊白介素1β及其受体拮抗因子荧光定量PCR检测方法的建立与应用[D]. 迟丹.吉林大学 2016
[2]绵羊白介素1β及其受体拮抗因子全长cDNA克隆、分子特性及差异表达分析[D]. 郭兴.吉林大学 2015



本文编号：3172122