捻转血矛线虫Hc38基因在毕赤酵母中的表达及生物学特性初探

发布时间：2021-05-07 00:24

　　Hc38基因位于捻转血矛线虫肠上皮微绒毛上，澳大利亚学者Hartman等（2001）在通过Northern杂交发现该基因在肠上皮微绒毛内呈高丰度表达，进而推测其表达产物是一种与吸血和免疫逃避有关的功能蛋白，为防治捻转血矛线虫病提供可靠的方法。本论文取得的主要研究结果如下：采用PCR方法从Hc38全长质粒中扩增出保守结构域HcP，并构建真核表达载体pPIC9K-HcP,电转法将其转入毕赤酵母GS115中,采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株，甲醇诱导表达,应用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况,并将表达蛋白用免疫亲和层析柱纯化，将纯化后的表达产物对牛、羊、鸡、兔、鼠的红细胞进行凝集试验，检测其凝集活性；对天然宿主羊的IgG、血红蛋白在体外进行孵育，应用SDS-PAGE检测降解情况。实验结果表明重组的GS115酵母菌株可表达分泌pHcP,其表达在96h达高峰,分泌量可达0.1mg/L，且纯化后的表达产物经Westernblot分析，能产生特异的免疫印迹条带，说明表达产物具有良好的反应原性。HcP表达产物对动物红细胞的凝集活性具有种属专一性；对天然宿主羊的IgG、血红蛋白都有降解... 

【文章来源】：石河子大学新疆维吾尔自治区 211工程院校

【文章页数】：62 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
主要英文缩写对照
第一章 文献综述
    综述一 捻转血矛线虫及Hc38基因研究进展
        1 捻转血矛线虫概述
            1.1 病原学
            1.2 生活史
            1.3 流行病学
            1.4 临床症状和病理变化
            1.5 诊断
            1.6 预防
        2 Hc38基因研究进展
    综述二 毕赤酵母表达外源基因的研究进展
        1 毕赤酵母表达系统的优点
        2 毕赤酵母的生物学特性
        3 毕赤酵母表达载体及元件
            3.1 表达载体
            3.2 启动子
            3.3 信号肽序列
            3.4 选择标记
        4 毕赤酵母的宿主菌
        5 毕赤酵母的转化及重组整合
            5.1 质粒在AOXI或aoxl::ARG4位点的插入[59]
            5.2 质粒在his4位点的插入
            5.3 质粒在AOXl位点的置换
        6 影响毕赤酵母表达外源基因的因素
            6.1 外源基因自身特性
            6.2 培养条件的影响
            6.3 载体菌株
            6.4 产物稳定性
第二章 实验部分
    实验一 捻转血矛线虫Hc38基因保守结构域在毕赤酵母中的表达
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
            1.2 方法
            1.3 电转化及重组酵母的筛选鉴定
            1.4 重组酵母菌株的诱导表达
            1.5 表达产物的SDS-PAGE分析[83]
            1.6 HcP表达产物的纯化[84]
            1.7 纯化产物反应原性的鉴定
        2 结果与分析
            2.1 HcP基因的扩增、克隆及测序
            2.2 重组表达载体pPIC9K-HcP的构建及PCR和双酶切鉴定
            2.3 重组酵母菌株GS115/pPIC9K-HcP的鉴定
            2.4 表达产物的SDS-PAGE检测
            2.5 目的蛋白的纯化
            2.6 纯化产物反应原性鉴定
        3 讨论
            3.1 载体pPIC9K-HcP的构建
            3.2 重组酵母表达株的筛选
            3.3 外源蛋白在毕赤酵母中表达的影响因素
    实验二 重组蛋白的生物学特性初探
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果与分析
            2.1 HcP表达产物的红血球凝集活性
            2.2 HcP表达产物对羊的血红蛋白的降解活性
            2.3 HcP表达产物对羊的IgG的降解作用
        3 讨论
            3.1 HcP蛋白的红血球凝集活性
            3.2 HcP蛋白降解血红蛋白的活性
            3.3 HcP蛋白降解免疫球蛋白(IgG)的活性
结论
创新点
参考文献
附录
作者简介
致谢
导师评阅表



本文编号：3172885