山羊卵泡期与黄体期“下丘脑—垂体—卵巢”miRNA分析及靶基因验证
发布时间：2021-05-10 18:59
本试验主要采用高通量测序,探究miRNA在山羊发情周期中差异表达变化,并预测其靶基因,通过GO和KEGG富集分析找出与山羊发情调控的相关通路。本研究将从表观遗传上,探究山羊发情周期中miRNA差异表达的变化,有利于阐述山羊发情规律分子机制,将为下一步的分子育种以及选育具有高繁殖力的种群奠定理论基础。（1）将采集到的安淮山羊卵泡期与黄体期的下丘脑、垂体、卵巢组织进行高通量测序。此次测序所建立的6个文库中,卵泡期下丘脑（FH）、黄体期下丘脑（LH）、卵泡期垂体（FP）、黄体期垂体（LP）、卵泡期卵巢（FO）、黄体期卵巢（LO）中分别得到12125000、11696869、11319069、11432846、11727490、12209928个原始序列,过滤掉低质量的序列得到11788536、11344763、11162888、11016438、11546193、12013471条纯净序列。（2）为得到6个文库中miRNA表达谱及其在山羊基因组中的具体信息,我们将对6个文库中的miRNA进行靶基因预测,并进行相关生物信息学分析。与NCBI上山羊基因组进行同源类比,FH、LH、FP、LP、FO...
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
英文缩略词表
文章综述
1.“下丘脑-垂体-卵巢轴”研究
1.1“下丘脑-垂体-卵巢轴”组成与功能
1.2“下丘脑-垂体-卵巢轴”负反馈调控机制研究
1.3 动物发情周期过程“下丘脑-垂体-性腺轴”研究
2 TGF-β 家族在卵泡发育中的研究进展
2.1 TGF-β 家族简介
2.2 TGF-β 家族与卵泡发育
3“下丘脑-垂体-卵巢轴”中与繁殖相关miRNAs研究
3.1 miRNAs的起源与作用机制研究
3.2 miRNA与下丘脑-垂体研究
3.3 miRNA与动物卵巢的研究
引言
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物及材料
1.1.2 主要仪器设备
1.1.3 主要试剂药品
1.2 试验方法与流程
1.2.1 卵泡期黄体期HPO差异表达miRNA分析
1.2.1.1 样本采集
1.2.1.2 总RNA提取
1.2.1.3 总RNA质量分析
1.2.1.4 测序文库的构建和测序分析
1.2.1.5 原始数据的过滤
1.2.1.6 Small RNA文库的分类注释
1.2.1.7 未知miRNA的预测
1.2.1.8 已知miRNA与未知miRNA的差异分析
1.2.1.9 表达模式聚类分析及其靶基因的预测
1.2.1.10 GO富集分析和KEGG通路分析miRNA的靶基因
1.2.1.11 定量验证高通量测序结果
1.2.2 山羊卵巢颗粒细胞的分离与鉴定
1.2.2.1 安淮山羊卵巢颗粒细胞分离
1.2.2.2 安淮山羊颗粒细胞的鉴定
1.2.3 验证chi-miR-144-3p靶向作用Follistian的试验
1.2.3.1 载体的构建
1.2.4 Follistian过表达与干扰载体的构建
1.2.4.1 载体构建FST基因CDS的扩增
1.2.4.2 PCR产物纯化
1.2.4.3 平末端克隆
1.2.4.5 p Topo-Blunt Simple载体与p LVX-IRES-Neo的双酶切
1.2.4.6 重组载体的构建
1.2.4.7 sh RNA2片段的设计与引物合成
1.2.4.8 引物退火
1.2.4.9 酶连及重组载体转化
1.2.5 慢病毒的包装以及感染卵巢颗粒细胞效果的验证
1.2.5.1 HEK-293T细胞的培养、转染以及病毒浓缩
1.2.5.2 病毒感染原代卵巢颗粒细胞效果的观察
2 结果与分析
2.1 电泳检测总RNA质量
2.2 文库RNA的质量分析
2.3 小RNA文库片段长短分布
2.4 公共及特有序列
2.5 sRNA比对山羊基因组
2.6 sRNA的分类注释
2.7 已知miRNA比对和新miRNA预测
2.8 已知miRNA和新miRNA的差异分析
2.9 已知miRNAs的表达模式的聚类分析
2.10 差异表达miRNA靶基因的GO分析
2.11 差异表达miRNA靶基因的KEGG分析
2.12 定量验证测序结果的趋势
2.13 山羊卵巢颗粒细胞的分离验证
2.14 验证卵巢卵泡期黄体期差异表达chi-miR1443p与FST靶向作用
2.15 过表达载体的构建
2.16 shRNA载体的构建
2.17 感染原代卵巢颗粒细胞效果鉴定
2.18 定量验证过表达与干扰效率
3. 讨论
3.1 山羊繁殖性状相关的miRNA挖掘
3.2 高通测序数据生物信息学分析
3.3 山羊卵巢颗粒细胞分离与鉴定
3.4 山羊目标miRNAs靶基因的验证
3.5 FST表达与干扰病毒载体构建与慢病毒的包装
4. 结论
参考文献
作者简介
本文编号：3179885
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
英文缩略词表
文章综述
1.“下丘脑-垂体-卵巢轴”研究
1.1“下丘脑-垂体-卵巢轴”组成与功能
1.2“下丘脑-垂体-卵巢轴”负反馈调控机制研究
1.3 动物发情周期过程“下丘脑-垂体-性腺轴”研究
2 TGF-β 家族在卵泡发育中的研究进展
2.1 TGF-β 家族简介
2.2 TGF-β 家族与卵泡发育
3“下丘脑-垂体-卵巢轴”中与繁殖相关miRNAs研究
3.1 miRNAs的起源与作用机制研究
3.2 miRNA与下丘脑-垂体研究
3.3 miRNA与动物卵巢的研究
引言
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物及材料
1.1.2 主要仪器设备
1.1.3 主要试剂药品
1.2 试验方法与流程
1.2.1 卵泡期黄体期HPO差异表达miRNA分析
1.2.1.1 样本采集
1.2.1.2 总RNA提取
1.2.1.3 总RNA质量分析
1.2.1.4 测序文库的构建和测序分析
1.2.1.5 原始数据的过滤
1.2.1.6 Small RNA文库的分类注释
1.2.1.7 未知miRNA的预测
1.2.1.8 已知miRNA与未知miRNA的差异分析
1.2.1.9 表达模式聚类分析及其靶基因的预测
1.2.1.10 GO富集分析和KEGG通路分析miRNA的靶基因
1.2.1.11 定量验证高通量测序结果
1.2.2 山羊卵巢颗粒细胞的分离与鉴定
1.2.2.1 安淮山羊卵巢颗粒细胞分离
1.2.2.2 安淮山羊颗粒细胞的鉴定
1.2.3 验证chi-miR-144-3p靶向作用Follistian的试验
1.2.3.1 载体的构建
1.2.4 Follistian过表达与干扰载体的构建
1.2.4.1 载体构建FST基因CDS的扩增
1.2.4.2 PCR产物纯化
1.2.4.3 平末端克隆
1.2.4.5 p Topo-Blunt Simple载体与p LVX-IRES-Neo的双酶切
1.2.4.6 重组载体的构建
1.2.4.7 sh RNA2片段的设计与引物合成
1.2.4.8 引物退火
1.2.4.9 酶连及重组载体转化
1.2.5 慢病毒的包装以及感染卵巢颗粒细胞效果的验证
1.2.5.1 HEK-293T细胞的培养、转染以及病毒浓缩
1.2.5.2 病毒感染原代卵巢颗粒细胞效果的观察
2 结果与分析
2.1 电泳检测总RNA质量
2.2 文库RNA的质量分析
2.3 小RNA文库片段长短分布
2.4 公共及特有序列
2.5 sRNA比对山羊基因组
2.6 sRNA的分类注释
2.7 已知miRNA比对和新miRNA预测
2.8 已知miRNA和新miRNA的差异分析
2.9 已知miRNAs的表达模式的聚类分析
2.10 差异表达miRNA靶基因的GO分析
2.11 差异表达miRNA靶基因的KEGG分析
2.12 定量验证测序结果的趋势
2.13 山羊卵巢颗粒细胞的分离验证
2.14 验证卵巢卵泡期黄体期差异表达chi-miR1443p与FST靶向作用
2.15 过表达载体的构建
2.16 shRNA载体的构建
2.17 感染原代卵巢颗粒细胞效果鉴定
2.18 定量验证过表达与干扰效率
3. 讨论
3.1 山羊繁殖性状相关的miRNA挖掘
3.2 高通测序数据生物信息学分析
3.3 山羊卵巢颗粒细胞分离与鉴定
3.4 山羊目标miRNAs靶基因的验证
3.5 FST表达与干扰病毒载体构建与慢病毒的包装
4. 结论
参考文献
作者简介
本文编号：3179885
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3179885.html
