鸭瘟病毒gC基因介导的宿主细胞吸附特性及gC - /TK - 双基因缺失株构建

发布时间：2021-05-10 21:01

　　鸭瘟是一种急性、热性、高度接触性传染病,该病对鸭、鹅、天鹅等造成的高发病率和高死亡率特征使其严重危害水禽业发展。本研究工作目的在于明确鸭瘟病毒（DPV） gC基因介导对宿主细胞的吸附特性,以及构建鸭瘟病毒gC^-/TK^-双基因缺失病毒株。主要研究内容和结果如下：1.鸭瘟病毒gC介导的吸附感染宿主细胞特性研究通过比较实验室前期构建的重组鸭瘟病毒gC缺失株（DPV-△gC-EGFP）与亲本株（DPV-CHv）对鸭胚成纤维细胞（DEF）吸附能力的差异及细胞表面硫酸乙酰肝素（HS）在其中的作用,探讨鸭瘟病毒gC介导的吸附感染宿主细胞的特性。首先,建立基于EGFP基因定量PCR检测DPV-△gC-EGFP和基于gC基因定量PCR检测DPV-CHv病毒DNA拷贝数的方法,检测病毒在DEF不同吸附时间和吸附1h后不同增殖时间病毒DNA拷贝数的差异,分析gC基因对病毒吸附的影响。结果DPV-△gC-EGFP和DPV-CHv均随着时间的延长病毒吸附量增加且于90 min时病毒吸附含量达峰值而稳定,各时间点DPV-CHv吸附细胞的病毒量均高于DPV-△gC-EGF... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：59 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
常用英文缩略词表
第一部分 文献综述
    1 与疱疹病毒感染吸附有关的主要基因及受体
    2 疱疹病毒gC的主要功能
        2.1 gC介导病毒吸附到宿主细胞
        2.2 gC参与病毒的增殖和释放
        2.3 gC与病毒毒力有关
    3 疱疹病毒基因缺失疫苗
        3.1 基因缺失疫苗的定义
        3.2 基因缺失疫苗的构建与筛选
        3.3 基因缺失疫苗的研究进展
    4 选题目的及意义
第二部分 试验研究
    第一章 鸭瘟病毒gC介导的吸附感染宿主细胞的特性研究
        1 试验材料
            1.1 毒株、质粒、抗体及鸭胚
            1.2 分子生物学试剂和耗材
            1.3 常用实验试剂及配制
                1.3.1 细胞培养及病毒核酸基因组DNA提取用溶液
                1.3.2 SDS-PAGE及western blot常用液体
            1.4 主要仪器
        2 试验方法
            2.1 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测DPV-△gC-EGFP、DPV-CHv方法的建立
                2.1.1 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR引物设计
                2.1.2 制备标准品
                2.1.3 构建SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR标准曲线
            2.2 gC对病毒吸附的影响
                2.2.1 病毒吸附能力的测定
                2.2.2 吸附能力的差异对病毒增殖的影响
            2.3 肝素、肝素酶对病毒吸附感染宿主细胞的影响
            2.4 DPV-gC与HS亲和力的测定
                2.4.1 DPV-gB、DPV-gC、DPV-gE原核表达蛋白的制备
                2.4.2 重组表达蛋白与HS亲和力试验
        3 试验结果
            3.1 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的建立及标准曲线的绘制
                3.1.1 检测EGFP基因实时荧光定量PCR方法及标准曲线
                3.1.2 检测gC基因实时荧光定量PCR方法及标准曲线
            3.2 DPV-AgC-EGFP与DPV-CHv的宿主细胞吸附能力
            3.3 肝素和肝素酶对病毒吸附感染宿主细胞的影响
            3.4 DPV-gC结合HS的能力检测
        4 分析与讨论
            4.1 病毒定量的方法
            4.2 鸭瘟病毒gC介导的的吸附感染宿主细胞的特性
    第二章 鸭瘟病毒gC~-/TK~-双基因缺失株构建及部分生长特性
        1 试验材料
            1.1 毒株
            1.2 菌株
            1.3 分子生物学试剂和耗材
            1.4 常用实验试剂及配制
                1.4.1 细胞培养及病毒核酸基因组DNA提取用溶液
                1.4.2 大肠杆菌感受态细胞制备及转化用溶液
                1.4.3 琼脂糖凝胶电泳相关溶液
            1.5 主要仪器
        2 试验方法
            2.1 Red重组敲除gC基因
                2.1.1 RCR引物设计
                2.1.2 同源打靶片段RCR扩增
                2.1.3 RCR产物回收
                2.1.4 含pKD46和DPV CHv-BAC-G感染性克隆DH10B感受态的制备
                2.1.5 电转化线性打靶片段gC左臂-FRT-kana-FRT-gC右臂
            2.2 拯救重组病毒DPV CHv-BAC-G△gC
                2.2.1 中量提取DPV CHv-BAC-G△gC
                2.2.2 拯救DPV CHv-BAC-G△gC重组病毒
                2.2.3 重组病毒DPV CHv-BAC-G△gC的鉴定
            2.3 DPV CHv-BAC-G△gC的gC回复突变株构建
                2.3.1 gC-kana线性片段的获取
                2.3.2 第一轮Red重组（将gC-kana重组到CHv-BAC-G△gC基因组）
                2.3.3 第二轮重组（pCP20去除kana抗性）
                2.3.4 RFLP分析
                2.3.5 CHv-BAC-G△gCR回复突变株的拯救及拯救病毒的鉴定
            2.4 CHv-BAC-G△gC、CHv-BAC-G△gCR的体外生物学特性初步研究
                2.4.1 空斑试验
                2.4.2 一步生长曲线
        3 试验结果
            3.1 Red重组敲除gC基因
            3.2 DPV CHv-BAC-G△gC的拯救及拯救病毒的鉴定
            3.3 gC回复突变株DPV CHv-BAC-G△gCR的构建
                3.3.1 gC-kana线性片段的获取
                3.3.2 CHv-BAC-G△gCR回复突变株第一轮Red重组及鉴定
                3.3.3 CHv-BAC-G△gCR回复突变株第二轮重组及鉴定
                3.3.4 RFLP分析
            3.4 gC回复突变株DPV CHv-BAC-GAgCR病毒的拯救及鉴定
            3.5 DPV CHv-BAC-G△gC、DPV CHv-BAC-G△gCR的生物学特性初步研究
                3.5.1 空斑试验
                3.5.2 一步生长曲线测定
        4 分析与讨论
            4.1 重组病毒的构建
            4.2 鸭瘟病毒gC~-/TK~-双基因缺失株部分生长特性
第三部分 结论
参考文献
致谢
附表


【参考文献】：
期刊论文
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[2]牛传染性鼻气管炎基因工程疫苗研究进展[J]. 徐琼,何宇乾,吴海燕.  中国畜牧兽医. 2012(11)
[3]绿色荧光蛋白标记的树突状细胞对体外培养的自然杀伤细胞的影响[J]. 赵良中,李瑶,张铎,陈爽,时文艳.  中国畜牧兽医. 2012(08)
[4]红色荧光蛋白和荧光素酶双报告基因转基因小鼠的建立[J]. 张余琴,林晓琳,贾俊双,谢饶英,樊全荣,赵尊兰,杨升,高飞,姚开泰,肖东.  中国癌症杂志. 2012(05)
[5]制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究[J]. 朱森康,黄磊,李燕飞,钟卫鸿,徐志南.  生物技术通报. 2011(10)
[6]携带红色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒载体的构建及其体外试验研究[J]. 卢建溪,阳莉,钱师宇,王强.  中国病理生理杂志. 2011(10)
[7]携带GFP绿色荧光标记的重组BAC-HSV-1 HF株的构建及其子代病毒的特性研究[J]. 刘新静,宋波,卢甲盟,王青志,韩志强,许予明.  病毒学报. 2011(03)
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[10]动物疱疹病毒基因工程疫苗的研究进展[J]. 蔡铭升,程安春,汪铭书.  黑龙江畜牧兽医. 2009(01)

博士论文
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[2]鸭瘟病毒gC基因的发现、原核表达和应用研究[D]. 徐超.四川农业大学 2008
[3]伪狂犬病gE-/gI-基因缺失突变株及禽流感假病毒的构建以及免疫效果的研究[D]. 张松林.华中农业大学 2008

硕士论文
[1]牛传染性鼻气管炎TK/gE基因缺失重组病毒的研究[D]. 定明.华中农业大学 2010
[2]鸭瘟病毒UL27基因主要抗原域蛋白的原核表达、纯化、抗体制备及应用[D]. 林丹.四川农业大学 2009
[3]猪伪狂犬病病毒gC基因的克隆及生物信息学分析[D]. 王键义.四川农业大学 2008



本文编号：3180054