猪源多肽类抗生素的真核表达及体外活性研究
发布时间：2021-05-10 22:53
本研究利用数字化基因表达谱（Digital Gene Expression Profile, DGEP）分析技术筛查感染猪繁殖与呼吸综合征病毒后差异表达的抗菌肽（Antimicrobial peptides, AMPs）,并通过实时荧光定量PCR对其进行检测。将筛查到的AMPs在毕赤酵母表达系统进行表达,经镍柱、离子交换柱和透析技术进行纯化后,获得纯度达95%以上的重组蛋白。采用抑菌实验、MTT法、扫描电镜、实时荧光定量PCR技术对重组AMPs的抑菌活性、细胞毒性和抗炎作用进行检测。结果显示：1.利用生物信息学、DGEP数据库和实时荧光定量PCR筛选出15个具有表达差异的AMPs；2.根据毕赤酵母（Pichia pastoris）的偏好性对AMPs的基因进行密码子优化并人工合成密码子优化的序列,通过DNA重组技术构建重组质粒,采用电转化的方法将线性化的重组质粒导入Pichia pastoris中,最终建立了能够表达CST11、NK-lysin和β-defensin-2三种猪源AMPs的重组毕赤酵母,重组酵母经甲醇诱导表达后,表达上清液经ProteinPure Ni-NTA介质、离子交换...
【文章来源】：山西农业大学山西省
【文章页数】：98 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
第一章 文献综述
1 AMPs的研究进展
1.1 AMPs的结构及作用机制
1.2 AMPs的生物学功能
1.3 AMPs的生产途径
2 Cystatin的研究进展
2.1 Cystatin的结构及其作用机制
2.2 Cystatin的生物学功能
2.3 Cystatin的体外表达研究
3 NK-lysin的研究进展
3.1 NK-lysin及其生物学活性
3.2 NK-lysin衍生肽及其生物学功能
4 β-defensin-2
4.1 defensin家族
4.2 pBD-2的研究进展
5 本研究的目的及研究内容
参考文献
第二章 基于数字表达谱分析技术筛查PRRS模型猪内源性AMPs
1 材料与方法
1.1 试验组织样品
1.2 主要仪器与试剂
1.3 试验方法
2 试验结果
2.1 差异基因的筛选
2.2 荧光定量PCR结果
3 讨论
4 小结
参考文献
第三章 猪可溶性cystatin 11的真核表达及体外活性研究
1 试验材料
1.1 质粒和菌株
1.2 主要仪器
1.3 所用试剂及其配制
2 试验方法
2.1 目的基因的获得
2.2 表达质粒pwPICZalpha的制备
2.3 重组表达载体的构建与鉴定
2.4 重组酵母的构建和鉴定
2.5 重组CST11的诱导表达与鉴定
2.6 重组CST11溶血活性的测定
2.7 重组CST11活性的测定
2.8 扫描电镜观察细菌形态
2.9 蛋白酶抑制试验
3 结果
3.1 重组CST11的Western blot鉴定
3.2 重组CST11的纯化
3.3 重组CST11的抗菌活性
3.4 重组CST11对细菌形态的影响
3.5 重组CST11的溶血活性
3.6 重组CST11的蛋白酶抑制活性
4 讨论
5 小结
参考文献
第四章 猪可溶性NK-lysin的真核表达及体外活性鉴定
1 试验材料
1.1 质粒和菌株
1.2 主要仪器
1.3 所用试剂及其配制
1.4 引物序列
2 试验方法
2.1 NK-lysin在毕赤酵母中的表达
2.2 重组NK-lysin的纯化
2.3 重组NK-lysin体外活性的测定
3 结果
3.1 重组NK-lysin的Western blot鉴定
3.2 重组NK-lysin的纯化结果
3.3 重组NK-lysin的体外活性
4 讨论
5 小结
参考文献
第五章 猪可溶性β-defensin-2的真核表达及体外活性研究
1 试验材料
1.1 质粒和菌株
1.2 主要仪器
1.3 所用试剂及其配制
1.4 引物序列
2 试验方法
2.1 β-defensin-2在毕赤酵母中的表达
2.2 重组β-defensin-2的纯化
2.3 重组β-defensin-2体外活性的测定
3 结果
3.1 重组β-defensin-2的Western blot鉴定
3.2 重组β-defensin-2的纯化结果
3.3 重组β-defensin-2的体外活性
4 讨论
5 小结
参考文献
全文结论
附录：在读期间课题相关科研论著与成果
Abstract
致谢
本文编号：3180208
【文章来源】：山西农业大学山西省
【文章页数】：98 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
第一章 文献综述
1 AMPs的研究进展
1.1 AMPs的结构及作用机制
1.2 AMPs的生物学功能
1.3 AMPs的生产途径
2 Cystatin的研究进展
2.1 Cystatin的结构及其作用机制
2.2 Cystatin的生物学功能
2.3 Cystatin的体外表达研究
3 NK-lysin的研究进展
3.1 NK-lysin及其生物学活性
3.2 NK-lysin衍生肽及其生物学功能
4 β-defensin-2
4.1 defensin家族
4.2 pBD-2的研究进展
5 本研究的目的及研究内容
参考文献
第二章 基于数字表达谱分析技术筛查PRRS模型猪内源性AMPs
1 材料与方法
1.1 试验组织样品
1.2 主要仪器与试剂
1.3 试验方法
2 试验结果
2.1 差异基因的筛选
2.2 荧光定量PCR结果
3 讨论
4 小结
参考文献
第三章 猪可溶性cystatin 11的真核表达及体外活性研究
1 试验材料
1.1 质粒和菌株
1.2 主要仪器
1.3 所用试剂及其配制
2 试验方法
2.1 目的基因的获得
2.2 表达质粒pwPICZalpha的制备
2.3 重组表达载体的构建与鉴定
2.4 重组酵母的构建和鉴定
2.5 重组CST11的诱导表达与鉴定
2.6 重组CST11溶血活性的测定
2.7 重组CST11活性的测定
2.8 扫描电镜观察细菌形态
2.9 蛋白酶抑制试验
3 结果
3.1 重组CST11的Western blot鉴定
3.2 重组CST11的纯化
3.3 重组CST11的抗菌活性
3.4 重组CST11对细菌形态的影响
3.5 重组CST11的溶血活性
3.6 重组CST11的蛋白酶抑制活性
4 讨论
5 小结
参考文献
第四章 猪可溶性NK-lysin的真核表达及体外活性鉴定
1 试验材料
1.1 质粒和菌株
1.2 主要仪器
1.3 所用试剂及其配制
1.4 引物序列
2 试验方法
2.1 NK-lysin在毕赤酵母中的表达
2.2 重组NK-lysin的纯化
2.3 重组NK-lysin体外活性的测定
3 结果
3.1 重组NK-lysin的Western blot鉴定
3.2 重组NK-lysin的纯化结果
3.3 重组NK-lysin的体外活性
4 讨论
5 小结
参考文献
第五章 猪可溶性β-defensin-2的真核表达及体外活性研究
1 试验材料
1.1 质粒和菌株
1.2 主要仪器
1.3 所用试剂及其配制
1.4 引物序列
2 试验方法
2.1 β-defensin-2在毕赤酵母中的表达
2.2 重组β-defensin-2的纯化
2.3 重组β-defensin-2体外活性的测定
3 结果
3.1 重组β-defensin-2的Western blot鉴定
3.2 重组β-defensin-2的纯化结果
3.3 重组β-defensin-2的体外活性
4 讨论
5 小结
参考文献
全文结论
附录：在读期间课题相关科研论著与成果
Abstract
致谢
本文编号：3180208
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